زراعة ماوس القلب صمامات في مصغرة نظام زراعة الأنسجة

Summary

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Abstract

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.

Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.

In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

Introduction

مرض صمام القلب هو سبب رئيسي للمراضة والوفيات في العالم الغربي. انتشاره يزيد مع التقدم في السن ويؤثر على أكثر من 10٪ من السكان 75 سنة فأكثر ^1. صمامات الجزء النظامية للقلب، والصمام الأورطي والتاجي، ومعظمهم من المتضررين. يتميز مرض صمام القلب من جراء فقدان هيكل درجة عالية من التنظيم للصمامات، الذي ينتج تغيير في الخواص الميكانيكية ^2. السلامة الهيكلية ذلك فمن الأهمية البالغة وظيفة الصمام.

وتتألف منشورات صمام الخلايا صمامي الخلالي (VIC)، الخلايا البطانية صمامي (VEC)، والمصفوفة خارج الخلية، الذي يتم تنظيمه للغاية في نمط الطبقات ^3،4. وفيكس هي المسؤولة عن تركيب ECM، وتدهور والتنظيم. العوامل النابعة من مجرى الدم، ECS أو المقيمين في فعل ECM على فيكس بتدبير وظيفتها. بالإضافة،تعمل القوى الميكانيكية على النشرة خلال دورة القلب مما أدى إلى الصفحي أو إجهاد القص متذبذبة، يؤكد الضغط أو الشد التأثير على سلوك فيكس ^5.

من أجل فهم كيفية تنظيم هيكل صمام، يجب أولا أن يفهم كيف فيكس لرد على مجموعة متنوعة من المحفزات شهدت خلال دورة القلب. وقد تم في الدراسات المختبرية مفيدة للغاية حول خصائص وقدرات الخلايا صمامي. استجابة هذه الخلايا في المختبر، ومع ذلك، قد لا تحاكي بدقة دائما الاستجابة في الجسم الحي ^6؛ على سبيل المثال، استجابة للمؤثرات VIC تعتمد على وجود ECS وتكوين ECM ^5. وعلاوة على ذلك، واستجابة خلايا صمامي للمنبهات تعتمد على مواقعها المحددة في النشرة ^7. بالإضافة إلى المحفزات الحيوية، يتم تحديد سلوك الخلايا صمامي من قبل القوات الميكانيكية س يتصرفن صمام ^8. يخضع كل منطقة من صمام لتشكيلتها الخاصة من الضغوط الدورة الدموية. على الرغم من أن النماذج الحالية فيفو السابقين قد أظهرت أن القوى الميكانيكية هي محددات هامة للبنية صمامي ^{5، والآليات} المرتبطة بها لا تزال غير واضحة. في حين قدمت النماذج في الجسم الحي نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير صمامي ^9،10، نظرة ثاقبة صمامي البيولوجيا الكبار لا تزال بعيدة المنال.

لذلك، تم وضع فيفو السابقين نموذج تدفق فيه صمامات القلب يمكن تربيتها في وضع طبيعي في القلب لفترة طويلة من الزمن ^11. هذا له ميزة أنه لا تزال الصمامات في شكلها الطبيعي وفيكس تجربة نفس البيئة كما هو الحال في الجسم الحي، مما يجعل ردود فيكس للمحفزات طبيعية قدر الإمكان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ثقافة الصمامات في وضعهم الطبيعي في قلب يسهل إخضاع كلالمنطقة صمامي لضغوط الدورة الدموية ذات الصلة. في هذا النموذج المجراة سابقا، أي نظام زراعة الأنسجة مصغرة (تلك الخلايا)، والصمامات يمكن أن تتعرض لمختلف المحفزات الحيوية والدورة الدموية مما يتيح للتحقيق لدورهم في القلب إعادة عرض الصمام.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية LUMC لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية.

1. إعداد الآلات، الثقافة المتوسطة، وتلك الخلايا

ملاحظة: إجراء كافة الاستعدادات في غطاء تدفق الصفحي. ووصف تلك الخلايا غرفة نضح، فخ فقاعة وموقف في ليبر وآخرون، 2010 ^(11).

1. تطهير ملقط ومقص الجزئي مع 70٪ من الإيثانول. تحضير حقنة 5 مل مع 21G إبرة مع معقم تايرود العازلة (130 ملي كلوريد الصوديوم، 5.4 ملي بوكل، 6.0 ملي HEPES، 1.2 ملي MgSO _4، 1.2 مم KH ₂ PO _4، 20 ملي الجلوكوز، 1.5 ملي CaCl ₂ .2H ₂ O، الرقم الهيدروجيني = 7.2). تحضير حقنة 5 مل مع 21G إبرة بمحلول معقم بوكل (100 ملم).
2. إعداد 65 مل من المتوسط ​​في القلب: DMEM تستكمل مع 10٪ الجنين العجل المصل، مضاد حيوي / مضاد فطري (A / A؛ 100 وحدة من البنسلين، 100 ميكروغرام من الستربتومايسين، و 0.25 ميكروغرام من الأمفوتريسين B / مل)، الانسولين Transferrin-السيلينيوم (ITS، و 10 ميكروغرام / مل الأنسولين، و 5.5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 6.7 نانوغرام / مل سيلينات الصوديوم) وفلتر تعقيم.
3. تعقيم غرفة نضح وفخ فقاعة عن طريق الرش مع 70٪ من الإيثانول والجافة مع منشفة ورقية. تجميع تلك الخلايا (الشكل 1D)، ومع ذلك، في البداية دون غرفة التروية. ضع في فخ فقاعة على الوقوف. استخدام مضخة الأسطوانة تحوي سهلة الحمل رؤساء المضخة.
   1. باستخدام أنبوب السيليكون إجراء اتصالات بين الخزان (أنبوب 50 مل)، ومضخة، مضخة وفخ فقاعة، في فخ فقاعة وخزان (انظر الشكل 1D). جعل الأنابيب داخل الحاضنة لفترة كافية للسماح المتوسطة للوصول إلى التوازن الغاز مع غاز في الحاضنة من خلال أنابيب الغاز قابلة للاختراق السيليكون (1 م) وأنابيب خارج الحاضنة قصيرة قدر الإمكان.
4. ملء أنبوب 50 مل مع 70٪ من الإيثانول، بدوره على مضخة (سرعة تدفق حوالي 1 مل / دقيقة للسماح التداول السليم)، والسماح للسي آي آر الإيثانولculate لمدة 30 دقيقة لتعقيم جميع الأنابيب. إزالة الإيثانول عن طريق إفراغ الخزان وتضخ الايثانول من النظام.
5. ملء أنبوب 50 مل بالماء المقطر المعقم، بدوره على مضخة والسماح للتعميم الماء لمدة 30 دقيقة للتخلص من الايثانول المتبقية. إزالة المياه من خلال تفريغ الخزان وتضخ المياه من النظام.
6. ملء أنبوب 50 مل مع 45 مل من المتوسط، وضعت الوقوف في الحاضنة. بدوره على (سرعة تدفق حوالي 1 مل / دقيقة) مضخة وتعميم المتوسطة لملء جميع الأنابيب، وإزالة جميع فقاعات الهواء، والسماح للالمتوسطة على التكيف مع تركيبة الغاز في الحاضنة لمدة 1 ساعة على الأقل. الحفاظ على الحاضنة في ظروف الأنسجة الثقافة القياسية (5٪ CO ₂ و 37 ° C). ضمان عدم وجود فقاعات موجودة في الأنبوب.

2. عزل القلب ماوس

1. حقن الفأر مع 500 وحدة من الهيبارين. هذا سوف يمنع الدم من التخثر، وتتيح للإزالة بlood من القلب. بعد 10 دقيقة، تخدير الماوس في غرفة الاستقراء مع 4٪ الأيزوفلورين باستخدام المرذاذ الدقة. التخدير كافية عندما الماوس لا يستجيب لقرصة أخمص قدميه.
2. نقل الماوس إلى لوحة تشريح والحفاظ على التخدير عن طريق قناع متصلة الدائرة المحورية. تطهير الفراء من الفأر مع الكحول 70٪. باستخدام مقص فتح تجويف البطن لفضح الوريد الأجوف والحجاب الحاجز.
3. لفضح القلب، وجعل الشقوق الجانبية ابتداء من آخر من الأضلاع الأولى وتعكس القفص الصدري فوق رأس الفأر. وقف التخدير كما الماوس لا يتنفس بعد الآن. مراقبة القلب النابض.
4. ادخال الإبرة 21G تعلق على حقنة 5 مل تحتوي على العازلة العقيمة تايرود في الوريد الأجوف السفلي من البطن إلى داخل التجويف الصدري (من خلال الحجاب الحاجز). تأكد من أن الدم يمكن الخروج من الذيلية الوريد الأجوف من غرز الإبرة. يروي عشرالعازلة البريد تايرود بلطف ومع الضغط المستمر في الوريد الأجوف حتى يفقد القلب جزئيا لونه أحمر. ملاحظة: لا يزال قلب ينبض السماح للإزالة الدم من القلب.
5. استبدال الإبر مع إبرة 21G تعلق على حقنة 5 مل تحتوي على حل بوكل العقيمة. يروي بلطف الحل بوكل في الوريد الأجوف حتى يتوقف القلب النابض وإزالة الإبرة. ملاحظة: الحل بوكل يحافظ على القلب في مرحلة الانبساطي استرخاء، والتي سوف تسمح الإدراج أسهل من الإبر نضح ونضح من نظام التاجي.
6. قليلا رفع القلب باستخدام ملقط المنحنية وباستخدام مقص تشريح القلب خالية من الأنسجة المحيطة ولكن ترك الشرايين والأوردة القريبة إلى القلب سليمة وتعلق على القلب. نقل قلب لأنبوب 15 مل تحتوي تستكمل PBS الجليد الباردة مع مضاد حيوي / مضاد فطري (A / A). تخزين قلب في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة لمدة تصل إلى 3 ساعات.

3. Cannulatioن من قلوب ماوس في غرفة الإرواء

1. تنفيذ كافة الإجراءات في غطاء تدفق الصفحي. تستكمل نقل قلب معزولة عن أنبوب 15 مل إلى صحن 10 سم بيتري وإضافة PBS مع A / A.
2. تحت المجهر تشريح، استخدم مقص الجزئي وملقط لإزالة جميع الأنسجة غير القلب ولكن الحفاظ على الأبهر الصاعد إلى ما لا يقل عن التشعب مع الشريان العضدي الرأسي والأوردة الرئوية، 2 مم الأقرب إلى القلب. قطع غيض من قمة القلب إلى خلق الوصول إلى تجويف البطين الأيسر (عادة 2 ملم). وضع غرفة نضح في غطاء تدفق تحت المجهر تشريح.
3. نعلق حقنة 5 مل مع المتوسطة إلى الإبرة إدراج باستخدام أنابيب السيليكون. ملء غرفة نضح مع 20 مل المتوسطة ووضع القلب في مرحلة التناوب بين الإبر اضعافها 2 في غرفة نضح (الشكل 1). ضبط ارتفاع مرحلة التناوب بحيث يتم وضع القلب أمامالإبر.

4. من ربط لزراعة صمام تاجي (انظر الشكل 1)

1. Ligate الشريان الأورطي مع خياطة (الحرير 7.0). Ligate لاحقة الأذين الأيسر مع خياطة. ادخال الإبرة (رقم 1 في الشكل 1) عن طريق الوريد الرئوي إلى الأذين الأيسر وligate مع خياطة الأقرب إلى دخولها في الأذين الأيسر. تأكد من أن الإبرة ليست بعيدة جدا في الأذين الأيسر حيث أن ذلك من شأنه أن يؤدي إلى تلف الصمام التاجي.
2. ادخال الإبرة (nr.2 في الشكل 1) مع الحركة الخطية إلى البطين الأيسر. نقل متوسطة من غرفة نضح إلى أنبوب 50 مل. ختم الإبرة إلى عضلة القلب مع الغراء حيويا.
3. بعد أن يجف الغراء، وضخ بعناية متوسطة إلى القلب من خلال ربط حقنة مليئة المتوسطة إلى إبرة nr.1 ومعرفة ما اذا كان هناك أي تسرب. تأكد من أن مخارج المتوسطة من nr.2 إبرة وperfused الدم آخر ما تبقى من القلب.

5. لىgation لزراعة صمام الأورطي (انظر الشكل 1)

1. ادخال الإبرة (nr.1 في الشكل 1) في الشريان الأورطي وligate مع خياطة. تأكد من أن الإبرة ليست بعيدة جدا في الشريان الأورطي لأن هذا من شأنه أن يؤدي إلى تلف الصمام الأبهري. ادخال الإبرة (nr.2 في الشكل 1) مع الحركة الخطية إلى البطين الأيسر. نقل متوسطة من غرفة نضح إلى أنبوب 50 مل. ختم الإبرة إلى عضلة القلب مع الغراء حيويا.
2. بعد أن يجف الغراء، وضخ بعناية المتوسطة في القلب من خلال ربط حقنة مليئة المتوسطة إلى إبرة nr.2 ومعرفة ما اذا كان هناك أي تسرب. تأكد من أن مخارج المتوسطة من nr.1 إبرة وperfused الدم آخر ما تبقى من القلب.

6. ضع غرفة الإرواء على حامل

1. تملأ غرفة نضح مع 20 مل نقل متوسطة. وضع طوقا وغطاء على غرفة وتشديد مع غسالة ومسامير.
2. إزالة تلك الخلايا تجميعها من incubaتور. نعلق غرفة نضح على الوقوف. توصيل أنابيب (انظر الشكل 1D). وضع الوقوف في حاضنة (5٪ CO ₂ و 37 ° C). توصيل الأنابيب إلى المضخة. بدوره على مضخة مع سرعة تدفق نحو 600 ميكرولتر / دقيقة.
3. تأكد من أن في الخزان و / أو فخ فقاعة مستوى المتوسطة يسمح للتصورات وجود تدفق قبل سقوط قطرات المتوسطة واردة. بعد والثقافة، وإزالة القلب من النظام، الثابتة وتجهيزها للفحص النسيجي.

النتائج

الصمام الأبهري (الشكل 2) أو صمام تاجي ¹¹ يمكن أن يكون مثقف لمدة 3 أيام على الأقل. من خلال زراعة في موقف فتح (والذي يمثل موقف الانقباضي للالصمام الأبهري وموقف الانبساطي للصمام التاجي)، تظل خلايا صمامي قابلة للحياة. يتم احترام أي موت الخلايا على النحو الذي ي?...

Discussion

وتشمل الخطوات الحاسمة في زراعة الصمامات الماوس القلب مما يجعل الوقت بين استئصال القلب من الماوس وربط في غرفة نضح قصيرة قدر الإمكان لضمان سلامة وربط الإبر عمودي على الصمامات لضمان الاتجاه الصحيح من تدفق . بالإضافة إلى ذلك، والتحقق من تدفق بعد ربط في غرفة نضح دون المتو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	life technolgies	10569-010
Fetal Bovine Serum	life technolgies	26140
Insulin-Transferrin-Selenium	life technolgies	41400-045
Antibiotic-Antimycotic	life technolgies	15240-06
Silk 7-0	Ethicon	768G
100 mm culture dish	Greiner bio-one	664160
50 ml tube	Greiner bio-one	227261
5 ml syringe	BD	309649
21 G needle	BD	304432
Heparin	LEO	012866-08
Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	Tedpella	1346
Silicon tubing	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
Silicon tubing for pump	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm
Biocompatible glue (Histoacryl)	B. Braun	1050071
precision vaporizer	Dräger	Vapor 200
peristaltic roller pump	Masterflex	7521-35
Easy-load pump head	Masterflex	7518-00
Flow chamber			see Lieber et al., 2010
Bubble trap			see Lieber et al., 2010