Culturing עכבר לב שסתומים במערכת תרבות רקמות זעירה

Summary

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Abstract

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.

Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.

In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

Introduction

מחלה שסתום לב היא אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה בעולם המערבי; שכיחותה עולה עם גיל, וזה משפיע על יותר מ -10% מאוכלוסיית השנים 75 ומעלה ^1. שסתומים של החלק המערכתי של הלב, שסתומים אב העורקים וצניפי, הם בעיקר מושפעים. מחלה שסתום לב מאופיינת באובדן של המבנה מאורגן של השסתומים, שתוצאתה השינוי של התכונות מכאניות ^2. השלמות המבנית ולכן קריטית לתפקוד של השסתום.

העלונים של השסתום מורכבים מתאים מסתמית ביניים (ויק), תאי האנדותל מסתמית (VEC), ומטריקס, המאורגן בתבנית שכבות ^3,4. VICS אחראי לסינתזת ECM, השפלה והארגון. גורמים הנובעים ממחזור הדם, ECS או מתגוררים במעשה ECM על VICS מנצח את תפקידו. בנוסף,כוחות מכאניים לפעול בעלון במהלך מחזור הלב וכתוצאה מכך למינרית או מאמץ הגזירה oscillatory, לחצי דחיסה או מתיחה המשפיעים על ההתנהגות של VICS ^5.

על מנת להבין כיצד המבנה של השסתום מוסדר, זה חייב להיות ראשון הבין איך VICS להגיב לקבוצה המגוונת של גירויים חוו במהלך מחזור הלב. מחקרים במבחנה היו מאוד אינפורמטיבי על המאפיינים והיכולות של התאים מסתמית. התגובה של תאים אלה במבחנה, עם זאת, לא תמיד בצורה מדויקת לחקות את התגובה בvivo ^6; לדוגמא, התגובה של ויק לגירויים תלויה בנוכחות של ECs והרכב ECM ^5. יתר על כן, התגובה של התאים מסתמית לגירויים תלויה במיקומם הספציפי בעלון ^7. בנוסף לגירויים ביוכימי, ההתנהגות של התאים מסתמית נקבעה על ידי כוחות מכאניים הפועלים on השסתום ^8. כל אזור של השסתום הוא נתון לסדרה הספציפית משלו של לחצים המודינמית. למרות שהמודלים הנוכחיים vivo לשעבר הראו כי כוחות מכאניים הם גורמים חשובים של מבנה מסתמים ^5, המנגנונים הקשורים עדיין אינם ברורים. בעוד מודלים in vivo סיפקו תובנה המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח מסתמים ^9,10, תובנות ביולוגיה מסתמית מבוגרת עדיין חמקמקות.

לכן, vivo לשעבר זרימת מודל פותח באשר יכולים להיות מתורבת שסתומי לב בעמדה הטבעית שלהם בלב לתקופה ממושכת של זמן ^11. זה היתרון שהסתומים להישאר בתצורה הטבעית שלהם וVICS לחוות את אותה הסביבה כמו בvivo, מה שהופך את התגובות לגירויים VICS טבעיים ככל האפשר. בנוסף, התרבות של השסתומים בעמדה הטבעית שלהם בלב מאפשרת להעמיד את כלאזור מסתמית ללחצים המודינמית הרלוונטיים. במודל זה vivo לשעבר, כלומר, מערכת תרבות רקמות זעירה (MTCS), יכולה להיות נתונה סתומה לגירויים ביוכימיים והמודינמית שונים המאפשרים החקירה של תפקידם בשיפוץ שסתום לב.

Protocol

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות LUMC של ועדת האתיקה מחקר בבעלי החיים.

1. הכנה של מכשירים, תרבות בינונית, וMTCS

הערה: בצע את כל ההכנות בזרימה למינרית. תא זלוף MTCS, מלכודת הבועה והעמדה מתוארות בליבר et al., 2010 ^11.

1. לחטא את המלקחיים ומספריים מיקרו עם 70% אתנול. הכן מזרק 5 מיליליטר עם מחט 21G עם הצפת (130 מ"מ NaCl של Tyrode סטרילי, 5.4 מ"מ KCl, 6.0 מ"מ Hepes, 1.2 מ"מ MgSO _4, 1.2 מ"מ KH ₂ PO _4, 20 מ"מ גלוקוז, 1.5 מ"מ CaCl ₂ .2H ₂ O, pH = 7.2). הכן מזרק 5 מיליליטר עם מחט 21G עם פתרון סטרילי KCl (100 מ"מ).
2. הכן 65 מיליליטר של מדיום ללב: DMEM בתוספת 10% עגל סרום עוברי, אנטיביוטיקה / antimycotic (/; פניצילין 100 יחידות, של סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם, ו0.25 UG של amphotericin B / מיליליטר), אינסולין-Transferrin-סלניום (ITS; 10 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 5.5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 6.7 ng / הסלניום נתרן מיליליטר) ולסנן לעקר.
3. לעקר את תא זלוף ומלכודת בועה על ידי ריסוס עם אתנול 70% ויבשים עם מגבת נייר. להרכיב את MTCS (1D איור), עם זאת, בתחילה בלי תא זלוף. מקם את מלכודת הבועה על הדוכן. השתמש במשאבת הרים פריסטלטיים ראשי משאבה קל עומס.
   1. שימוש בצינורות סיליקון ליצור קשרים בין המאגר (שפופרת 50 מיליליטר) והמשאבה, המשאבה ומלכודת הבועה, בועת המלכודת והמאגר (ראה איור 1D). הפוך את צינורות בתוך האינקובטור ארוך מספיק כדי לאפשר בינוני להגיע לשיווי משקל גז עם הגז בחממה דרך צינורות הגז החדירים סיליקון (1 מ ') והצינורות מחוץ לחממה הקצרה ככל האפשר.
4. מלא את צינור 50 מיליליטר עם 70% אתנול, להפעיל את המשאבה (מהירות זרימה סביב 1 מיליליטר / דקה כדי לאפשר זרימה תקינה) ולתת CIR אתנולculate למשך 30 דקות כדי לעקר את כל צינורות. הסר את אתנול על ידי ריקון המאגר והשאיבה החוצה אתנול מהמערכת.
5. מלא את צינור 50 מיליליטר עם מים מזוקקים סטריליים, להפעיל את המשאבה ולתת לזרום המים למשך 30 דקות להיפטר נותר אתנול. הסר את המים על ידי ריקון המאגר ושאיבה החוצה את המים מהמערכת.
6. מלא את צינור 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר של מדיום, לשים את הדוכן בחממה. הפעל את המשאבה (מהירות זרימה סביב 1 מיליליטר / דקה) ולהפיץ את המדיום כדי למלא את כל צינורות, להסיר את כל בועות האוויר ולאפשר בינוניים להסתגל לרכב הגז בחממה במשך שעה לפחות 1. לשמור על החממה בתנאים סטנדרטיים רקמות תרבות (5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס). ודא שאין בועות נמצאות בצינור.

2. בידוד של לב העכבר

1. הזרק את העכבר עם 500 יחידות של הפרין. זה ימנע את קרישת הדם ומאפשר את הסרת באת מזון מהלב. לאחר 10 דקות, להרדים את העכבר בתא אינדוקציה עם isoflurane 4% באמצעות אידוי דיוק. ההרדמה היא מספיק כאשר העכבר אינו מגיב לקמצוץ הבוהן.
2. העבר את העכבר ללוח לנתיחה ולשמור על הרדמה באמצעות facemask מחובר למעגל קואקסיאליים. לחטא את הפרווה של העכבר עם אלכוהול 70%. בעזרת מספריים לפתוח את חלל הבטן לחשוף את הווריד הנבוב והסרעפת.
3. כדי לחשוף את הלב, לעשות חתכים רוחב החל מהאחרונות לצלעות הראשונות ומשקפים את כלוב בית החזה מעל ראשו של העכבר. לעצור את ההרדמה כעכבר לא נושם יותר. שים לב לפעימות הלב.
4. הכנס את מחט 21G מצורפת מזרק 5 מיליליטר מכיל המאגר של Tyrode סטרילי לתוך הווריד הנבוב הנחות מהבטן לתוך חלל בית החזה (דרך סרעפת). ודא שהדם יכול לצאת מזנב הווריד הנבוב מהחדרת המחט. Perfuse ההמאגר של הדואר Tyrode בעדינות ועם לחץ מתמיד לווריד הנבוב עד הלב מאבד חלקו הצבע האדום שלו. הערה: הלב נשאר להכות מאפשר הסרת הדם מהלב.
5. החלף את המחט עם מחט 21G מצורפת מזרק 5 מיליליטר מכיל פתרון KCl סטרילי. בעדינות perfuse פתרון KCl לתוך הווריד הנבוב עד הלב מפסיק לפעום ולהסיר את המחט. הערה: פתרון KCl משמר את הלב בשלב הדיאסטולי רגוע, שיאפשר כניסה קלה יותר של מחטי זלוף וטפטוף של מערכת הלב.
6. מעט להרים את הלב באמצעות מלקחיים מעוקלים ומספריים באמצעות לנתח את הלב חופשי מרקמות אך להשאיר עורקים וורידים הפרוקסימלי ללב שלם ומחובר ללב. העבר את הלב לצינור 15 מיליליטר מכיל PBS קר כקרח בתוספת (/) אנטיביוטי / antimycotic. אחסן את הלב בPBS קר כקרח עד 3 שעות.

3. Cannulation של לבבות העכבר בתא זלוף

1. לבצע את כל ההליכים בזרימה למינרית. העבר את הלב מבודד מצינור 15 מיליליטר לצלחת פטרי 10 סנטימטרים ולהוסיף PBS בתוספת /.
2. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במספריים ומלקחי מיקרו כדי להסיר את כל הרקמה הלא-הלב אלא לשמר את אב העורקים עולים לפחות ההסתעפות עם עורק brachiocephalic והוורידים הריאה, הפרוקסימלי 2 מ"מ ללב. חותך את קצה הקודקוד של הלב כדי ליצור גישה ללום החדר השמאלי (בדרך כלל 2 מ"מ). מניחים את חדר זלוף בזרימת מכסה המנוע תחת מיקרוסקופ לנתח.
3. צרף מזרק 5 מיליליטר עם מדיום למחט הכנס באמצעות צינורות סיליקון. למלא את תא זלוף עם 20 מיליליטר בינוני ולשים לב על הבמה הסיבוב בין 2 המחטים קהות בתא זלוף (איור 1). התאם את הגובה של שלב הרוטציה כך הלב ממוקם מולמחטים.

4. קשירת לCulturing שסתום צניפי (ראה איור 1)

1. לקשור את אב העורקים עם תפר (משי 7.0). לקשור את תוספת פרוזדורי שמאל עם תפר. הכנס את המחט (NR. 1 באיור 1) דרך עורק הריאה לפרוזדור השמאלי ולקשור עם הפרוקסימלי תפר לכניסתה בפרוזדור השמאלי. ודא את המחט היא לא רחוקה מדי לאטריום השמאל כמו זה יפגע בשסתום צניפי.
2. הכנס את המחט (nr.2 באיור 1) עם תנועה ליניארית לתוך החדר השמאלי. העבר הבינוני מתא זלוף לצינור 50 מיליליטר. חותם את המחט לשריר הלב עם דבק ביולוגית.
3. לאחר הדבק התייבש, להזריק בזהירות בינונית ללב על ידי חיבור מזרק מלא בינוני לעקוץ nr.1 ולבדוק אם יש דליפה כלשהי. ודא שיציאות בינוניות מnr.2 המחט והדם האחרון שנותר הוא perfused מתוך הלב.

5. ליgation לCulturing שסתום אבי העורקים (ראה איור 1)

1. הכנס את המחט (nr.1 באיור 1) באב העורקים ולקשור עם תפר. ודא את המחט היא לא רחוקה מדי לאב העורקים כזה יפגע בשסתום אב העורקים. הכנס את המחט (nr.2 באיור 1) עם תנועה ליניארית לתוך החדר השמאלי. העבר הבינוני מתא זלוף לצינור 50 מיליליטר. חותם את המחט לשריר הלב עם דבק ביולוגית.
2. לאחר הדבק התייבש, להזריק בזהירות בינונית ללב על ידי חיבור מזרק מלא בינוני לעקוץ nr.2 ולבדוק אם יש דליפה כלשהי. ודא שיציאות בינוניות מnr.1 המחט והדם האחרון שנותר הוא perfused מתוך הלב.

6. מקום זלוף הלשכה במעמד

1. למלא את תא זלוף עם 20 מיליליטר הועבר בינוני. הנח אטם ומכסה על החדר ולהדק עם מכונת כביסה וברגים.
2. הסר את MTCS הורכב מאינקובטוריםטור. צרף את תא זלוף על הדוכן. חבר את צינורות (ראה איור 1D). הנח את העמדה בחממה (5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס). חבר את הצינור למשאבה. הפעל את המשאבה עם מהירות זרימה כ -600 μl / דקה.
3. ודא כי במאגר ו / או מלכודת בועת רמת בינונית מאפשרת חזותי של הנוכחות של הזרימה על ידי הנפילה של הטיפות בינוניות הנכנסות. אחרי התרבות, הלב יוסר מהמערכת, קבוע ומעובד לבדיקה היסטולוגית.

תוצאות

שסתום אב העורקים (איור 2) או צניפי ¹¹ שסתום יכול להיות מתורבת לפחות 3 ימים. על ידי culturing במצב הפתוח (המייצג את העמדה הסיסטולי לשסתום אב העורקים ואת המיקום הדיאסטולי לשסתום צניפי), תאים מסתמית להישאר קיימא. לא מוות של תאים הוא ציין, כפי שנקבע על ידי בהעדר תאי ...

Discussion

שלבים קריטיים בculturing שסתומי לב העכבר כוללים ביצוע הזמן בין הכריתה של הלב מהעכבר והקשירה בתא זלוף הקצר ככל האפשר על מנת להבטיח יכולת קיום וקשירה של המחטים בניצב לשסתומים כדי להבטיח כיוון נכון של הזרימה . בנוסף, בדיקת הזרימה לאחר קשירה בתא זלוף ללא בינוני מבטיחה הכנסה ו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	life technolgies	10569-010
Fetal Bovine Serum	life technolgies	26140
Insulin-Transferrin-Selenium	life technolgies	41400-045
Antibiotic-Antimycotic	life technolgies	15240-06
Silk 7-0	Ethicon	768G
100 mm culture dish	Greiner bio-one	664160
50 ml tube	Greiner bio-one	227261
5 ml syringe	BD	309649
21 G needle	BD	304432
Heparin	LEO	012866-08
Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	Tedpella	1346
Silicon tubing	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
Silicon tubing for pump	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm
Biocompatible glue (Histoacryl)	B. Braun	1050071
precision vaporizer	Dräger	Vapor 200
peristaltic roller pump	Masterflex	7521-35
Easy-load pump head	Masterflex	7518-00
Flow chamber			see Lieber et al., 2010
Bubble trap			see Lieber et al., 2010