Coltura mouse cardiaca Valvole in miniatura Tissue Culture Sistema

Riepilogo

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Abstract

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.

Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.

In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

Introduzione

Malattia della valvola cardiaca è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo occidentale; la sua prevalenza aumenta con l'età e colpisce oltre il 10% della popolazione di 75 anni e più ^1. Le valvole della parte sistemica del cuore, le valvole aortica e mitrale, sono per lo più colpite. Malattia della valvola cardiaca è caratterizzata dalla perdita della struttura altamente organizzata delle valvole, che provoca l'alterazione delle proprietà meccaniche ^2. L'integrità strutturale è quindi cruciale per il funzionamento della valvola.

Le foglioline della valvola sono costituiti da cellule interstiziali valvolari (VIC), cellule endoteliali valvolari (VEC) e matrice extracellulare, che è altamente organizzato in un modello a strati ^3,4. I VIC sono responsabili della sintesi ECM, degradazione e organizzazione. Fattori che emana dal flusso sanguigno, EC o residenti in atto ECM sulle VIC orchestrare la sua funzione. In aggiunta,forze meccaniche del foglio durante il ciclo cardiaco conseguente laminare o sollecitazione di taglio oscillatoria, sollecitazioni di compressione o di trazione che influenzano il comportamento di VIC ^5.

Per comprendere come è regolata la struttura della valvola, deve prima essere compreso come VIC rispondere alle diverse serie di stimoli sperimentati durante il ciclo cardiaco. Studi in vitro sono stati molto informato circa le caratteristiche e le abilità delle cellule valvolari. La risposta di queste cellule in vitro, tuttavia, non sempre simulare accuratamente la risposta in vivo ^6; per esempio, la risposta agli stimoli VIC dipende dalla presenza di cellule endoteliali e la composizione ECM ^5. Inoltre, la risposta delle cellule valvolari agli stimoli dipende dalla loro posizione specifica nel foglietto ^7. Oltre agli stimoli biochimici, il comportamento delle cellule valvolari è determinata da forze meccaniche o agisconon la ^valvola 8. Ogni regione della valvola è sottoposto a un insieme specifico di sollecitazioni emodinamiche. Sebbene attuali ex vivo i modelli hanno dimostrato che le forze meccaniche sono importanti determinanti della struttura valvolare ^5, i meccanismi associati sono ancora poco chiari. Mentre i modelli in vivo hanno fornito informazioni sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo valvolare ^9,10, intuizioni adulto valvolare biologia è ancora sfuggente.

Pertanto, un modello in vivo ex flusso è stato sviluppato in cui le valvole cardiache possono essere coltivati ​​nella loro posizione naturale nel cuore per un periodo di tempo prolungato ^11. Questo ha il vantaggio che le valvole rimangono nella loro configurazione naturale e le VIC sperimentano lo stesso ambiente in vivo, rendendo le risposte VICS a stimoli più naturale possibile. Inoltre, la cultura delle valvole nella loro posizione naturale nel cuore facilita sottoponendo ogniregione valvolare alle relative sollecitazioni emodinamiche. In questo modello ex vivo, cioè, il Sistema Miniature Tissue Culture (MTC), le valvole possono essere sottoposto a diversi stimoli biochimici ed emodinamici permettendo l'indagine del loro ruolo nel rimodellamento della valvola cardiaca.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida LUMC dell'animale comitato etico della ricerca.

1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e MTC

Nota: eseguire tutti i preparativi in ​​cappa a flusso laminare. La MTC camera di perfusione, trappola per bolle e supporto sono descritti in Lieber et al., ²⁰¹⁰ 11.

1. Disinfettare le pinze e forbici micro con il 70% di etanolo. Preparare una siringa da 5 ml con 21G ago con tampone (130 NaCl sterile Tyrode mM, 5,4 mM KCl, 6.0 mM Hepes, 1.2 MgSO _mm 4, 1,2 mm KH _{2 PO} 4, 20 Glucosio mM, 1,5 mM CaCl ₂ .2H _{2 O,} pH = 7.2). Preparare una siringa da 5 ml con ago 21G con la soluzione KCl sterile (100 mm).
2. Preparare 65 ml di terreno per cuore: DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino, antibiotici / antimicotici (A / A; 100 unità di penicillina, 100 mg di streptomicina, e 0,25 ug di amfotericina B / ml), insulino-Transferrin-Selenio (ITS; 10 mg / ml di insulina, 5.5 mg / ml transferrina, 6.7 ng / ml selenito di sodio) e filtro sterilizzare.
3. Sterilizzare la camera di perfusione e gorgogliatore spruzzando con il 70% di etanolo e asciugare con carta assorbente. Assemblare la MTC (Figura 1D), tuttavia, inizialmente senza la camera di perfusione. Posizionare la trappola bolla sul cavalletto. Utilizzare una pompa peristaltica a rulli con testate pompa facile carico.
   1. Utilizzando tubo in silicone effettuare le connessioni tra il serbatoio (tubo da 50 ml) e la pompa, la pompa e il gorgogliatore, il gorgogliatore e serbatoio (Figura 1D). Rendere il tubo all'interno dell'incubatrice abbastanza lungo da permettere medio raggiungimento dell'equilibrio gas con il gas nell'incubatrice attraverso il tubo di gas permeabile silicio (1 m) e il tubo all'esterno dell'incubatrice più breve possibile.
4. Riempire il tubo da 50 ml con il 70% di etanolo, accendere la pompa (velocità del flusso intorno a 1 ml / min per consentire la corretta circolazione) e lasciare che il CIR etanolocolare per 30 min per sterilizzare tutti i tubi. Rimuovere l'etanolo svuotando il serbatoio e pompando l'etanolo dal sistema.
5. Riempire il tubo da 50 ml di acqua distillata sterile, accendere la pompa e lasciare circolare l'acqua per 30 minuti per sbarazzarsi di etanolo residuo. Rimuovere l'acqua svuotando il serbatoio e pompare l'acqua dal sistema.
6. Riempire il tubo da 50 ml con 45 ml di terreno, mettere lo stand nell'incubatrice. Accendere il (velocità di flusso di circa 1 ml / min) e pompa circolare il mezzo di riempire tutti i tubi, rimuovere tutte le bolle d'aria e permettere il mezzo di adattarsi alla composizione del gas nell'incubatrice per almeno 1 ora. Mantenere l'incubatore a condizioni di coltura tissutale-standard (5% di CO ₂ e 37 ° C). Assicurarsi che non siano presenti bolle nel tubo.

2. Isolamento di Cuore mouse

1. Iniettare il mouse con 500 unità di eparina. Ciò impedirà la coagulazione del sangue e consente la rimozione di blood dal cuore. Dopo 10 min, anestetizzare il mouse in una camera di induzione con 4% isoflurano utilizzando un vaporizzatore di precisione. L'anestesia è sufficiente quando il mouse non risponde a pizzico piedi.
2. Trasferire il mouse per una tavola di dissezione e mantenere l'anestesia mediante una maschera facciale collegato ad un circuito coassiale. Disinfettare la pelliccia del mouse con il 70% di alcol. Utilizzando le forbici aprire la cavità addominale per esporre la vena cava e il diaframma.
3. Per esporre il cuore, fare incisioni laterali a partire dall'ultimo al primo costole e riflettono la gabbia toracica sopra la testa di topo. Arrestare il anestesia come mouse non respira più. Osservare il battito del cuore.
4. Inserire l'ago 21G attaccato ad una siringa da 5 ml contenente tampone sterile Tyrode nella vena cava inferiore dalla addominale nella cavità toracica (attraverso diaframma). Assicurarsi che il sangue possa uscire dalla vena cava caudale dall'inserzione dell'ago. Profumato °Buffer e Tyrode delicatamente e con pressione costante nella vena cava fino a quando il cuore perde in parte il suo colore rosso. Nota: Il cuore rimane battere permettendo la rimozione del sangue dal cuore.
5. Sostituire l'ago con l'ago 21G attaccato ad una siringa da 5 ml contenente soluzione KCl sterile. Profumato delicatamente la soluzione KCl nella vena cava fino a quando il cuore smette di battere e rimuovere l'ago. Nota: La soluzione KCl preserva cuore nella fase diastolica rilassata, che consentirà più facile inserimento degli aghi e perfusione perfusione del sistema coronarico.
6. Sollevare leggermente il cuore con pinze curve e con le forbici sezionano il cuore libero dal tessuto circostante, ma lasciano arterie e le vene prossimali al cuore intatto e collegato al cuore. Trasferire il cuore ad una provetta da 15 ml contenente PBS ghiacciato integrato con antibiotici / antimicotici (A / A). Conservare il cuore in PBS freddo per un massimo di 3 ore.

3. Cannulation dei Cuori mouse nella camera di perfusione

1. Eseguire tutte le procedure di cappa a flusso laminare. Trasferire il cuore isolato dal tubo 15 ml per un piatto di 10 centimetri di Petri e aggiungere PBS integrato con A / A.
2. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare il micro forbice e pinze per rimuovere tutto il tessuto non cardiaca ma preservare l'aorta ascendente almeno alla biforcazione con l'arteria anonima e le vene polmonari, 2 mm prossimale al cuore. Tagliare la punta della punta del cuore per creare l'accesso al lume del ventricolo sinistro (tipicamente 2 mm). Posizionare la camera di perfusione nella cappa a flusso sotto il microscopio da dissezione.
3. Attaccare una siringa da 5 ml con il mezzo all'ago inserto utilizzando il tubo in silicone. Riempire la camera di perfusione con 20 ml di mezzo e mettere il cuore sul palco di rotazione tra i 2 aghi smussati nella camera di perfusione (Figura 1). Regolare l'altezza della fase di rotazione in modo che il cuore è posizionato di fronte allaaghi.

4. legatura per la coltura della valvola mitrale (vedi Figura 1)

1. Legare l'aorta con sutura (seta 7.0). Legare l'appendice atriale sinistra con sutura. Inserire l'ago (nr. 1 in figura 1) attraverso la vena polmonare in atrio sinistro e legare con sutura prossimale alla sua entrata nell'atrio sinistro. Assicurarsi che l'ago non è troppo lontano in atrio sinistro in quanto ciò danneggerebbe la valvola mitrale.
2. Inserire l'ago (nr.2 in figura 1) con moto lineare nel ventricolo sinistro. Trasferire il terreno dalla camera di perfusione in una provetta da 50 ml. Sigillare l'ago al miocardio con colla biocompatibile.
3. Dopo che la colla si è asciugata, iniettare attentamente medio nel cuore collegando una siringa riempita di medio all'ago nr.1 e verificare se vi siano perdite. Garantire che le uscite medie di ago nr.2 e l'ultimo sangue rimanente viene perfuso dal cuore.

5. Ligazione per la coltura della valvola aortica (vedi Figura 1)

1. Inserire l'ago (nr.1 in figura 1) nell'aorta e legare con suture. Assicurarsi che l'ago non è troppo lontano in aorta poiché ciò danneggiare la valvola aortica. Inserire l'ago (nr.2 in figura 1) con moto lineare nel ventricolo sinistro. Trasferire il terreno dalla camera di perfusione in una provetta da 50 ml. Sigillare l'ago al miocardio con colla biocompatibile.
2. Dopo che la colla si è asciugata, iniettare attentamente medio nel cuore collegando una siringa riempita di medio all'ago nr.2 e verificare se vi siano perdite. Garantire che le uscite medie di ago nr.1 e l'ultimo sangue rimanente viene perfuso dal cuore.

6. Mettere Perfusion Camera Stand

1. Riempire camera di perfusione con i 20 ml trasferiti medio. Mettere guarnizione e coperchio sulla camera e stringere con rondella e viti.
2. Rimuovere i MTC assemblati dal incubazionetor. Fissare la camera di perfusione sul cavalletto. Collegare il tubo (vedi Figura 1D). Posizionare il supporto in incubatrice (5% di CO ₂ e 37 ° C). Collegare il tubo alla pompa. Accendere la pompa con velocità del flusso circa 600 ml / min.
3. Assicurarsi che nel serbatoio e / o il gorgogliatore il livello del fluido consente le visualizzazioni della presenza del flusso dalla caduta delle gocce medie in entrata. Dopo coltura, il cuore viene rimosso dal sistema, fissi ed elaborati per l'esame istologico.

Risultati

La valvola aortica (Figura 2) o valvola mitrale ¹¹ possono essere coltivate per almeno 3 giorni. Coltivando in posizione aperta (che rappresenta la posizione sistolico della valvola aortica e la posizione diastolica per la valvola mitrale), cellule valvolari rimangono vitali. Nessuna morte cellulare è osservato come determinato dall'assenza di TUNEL-positive cellule (Figura 2H, I) o spaccati caspasi-3 espressione (non mostrato e Lieber et al., ²⁰¹⁰ 11...

Discussione

Fasi critiche coltivando le valvole cardiache di topo comprendono rendendo il tempo tra escissione del cuore dal mouse e la legatura nella camera di perfusione più breve possibile per la sussistenza e legatura degli aghi perpendicolare alle valvole per assicurare la corretta direzione del flusso . Inoltre, il controllo della portata dopo legatura nella camera di perfusione senza prodotto garantisce il corretto inserimento e legatura di aghi. È fondamentale mantenere una cultura sterile, di evitare bolle d'aria nel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	life technolgies	10569-010
Fetal Bovine Serum	life technolgies	26140
Insulin-Transferrin-Selenium	life technolgies	41400-045
Antibiotic-Antimycotic	life technolgies	15240-06
Silk 7-0	Ethicon	768G
100 mm culture dish	Greiner bio-one	664160
50 ml tube	Greiner bio-one	227261
5 ml syringe	BD	309649
21 G needle	BD	304432
Heparin	LEO	012866-08
Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	Tedpella	1346
Silicon tubing	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
Silicon tubing for pump	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm
Biocompatible glue (Histoacryl)	B. Braun	1050071
precision vaporizer	Dräger	Vapor 200
peristaltic roller pump	Masterflex	7521-35
Easy-load pump head	Masterflex	7518-00
Flow chamber			see Lieber et al., 2010
Bubble trap			see Lieber et al., 2010