Cultura Rato Cardiac Valves no Sistema de Cultura de Tecidos Miniature

Resumo

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Resumo

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.

Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.

In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

Introdução

Doença valvar cardíaca é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo ocidental; sua prevalência aumenta com a idade e afeta mais de 10% da população de 75 anos ou mais ^1. As válvulas da parte sistêmica do coração, as valvas aórtica e mitral, são os mais afetados. Válvula cardíaca doença é caracterizada pela perda da estrutura altamente organizada das válvulas, o que resulta na alteração das propriedades mecânicas ^2. A integridade estrutural é, portanto, crucial para a função da válvula.

Os folhetos da válvula são constituídos por células intersticiais valvulares (VIC), células endoteliais valvulares (VEC), e matriz extracelular, o que é altamente organizado num padrão em camadas ^3,4. Os VICs são responsáveis ​​pela síntese de ECM, degradação e organização. Fatores que emana da corrente sanguínea, ECs ou residentes no ato ECM nas VICs orquestrando sua função. Além,forças mecânicas agir sobre o folheto durante o ciclo cardíaco, resultando em laminar ou tensão de cisalhamento oscilatório, tensões de compressão ou de tracção que influenciam o comportamento de VICs ^5.

A fim de compreender como a estrutura da válvula é regulado, ele deve primeiro ser compreendida como VICs responder ao conjunto diversificado de estímulos experimentadas durante o ciclo cardíaco. Estudos in vitro têm sido muito informativo sobre as características e capacidades das células valvulares. A resposta destas células, in vitro, no entanto, nem sempre podem mimetizar com exactidão a resposta in vivo ^6; Por exemplo, a resposta a estímulos de VIC é dependente da presença de células endoteliais e a composição ⁵ ECM. Além disso, a resposta das células a estímulos valvulares depende da sua localização específica no folheto ^7. Além disso a estímulos bioquímicos, o comportamento das células valvulares é determinada por forças mecânicas que actuam ón a válvula ^8. Cada região da válvula é submetida a seu próprio conjunto específico de tensões hemodinâmicas. Embora atuais modelos ex vivo têm mostrado que as forças mecânicas são importantes determinantes da estrutura valvular ^5, os mecanismos associados ainda não estão claros. Enquanto os modelos in vivo têm fornecido insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento valvular ^9,10, insights sobre biologia valvular adulto ainda é indescritível.

Por conseguinte, um modelo ex vivo de fluxo foi desenvolvido em que as válvulas cardíacas podem ser cultivadas na sua posição natural no coração por um período prolongado de tempo ^11. Isto tem a vantagem de que as válvulas permanecem na sua configuração natural e os VICs experimentar o mesmo ambiente como in vivo, fazendo com que as respostas a estímulos VICs tão natural quanto possível. Além disso, a cultura das válvulas na sua posição natural no coração facilita a sujeição de cada umregião valvular às tensões hemodinâmicas relevantes. Neste modelo ex vivo, isto é, o sistema de cultura de tecidos em miniatura (MTCS), as válvulas podem ser submetidos a diferentes estímulos bioquímicos e hemodinâmicas, permitindo o estudo do seu papel na remodelação da válvula cardíaca.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes LUMC do animal comitê de ética em pesquisa.

1. Preparação de Instrumentos, Meio de Cultura, e MTCS

Nota: Execute todos os preparativos na capela de fluxo laminar. O MTCS câmara de perfusão, borbulhador e suporte são descritos na Lieber et al., 2010 ^11.

1. Desinfectar os fórceps e micro tesoura com etanol 70%. Prepara-se uma seringa de 5 mL com uma agulha 21G com NaCl estéril de Tyrode Buffer (130 mM, KCl 5,4 mM, HEPES 6,0 mM, 1,2 MgSO ₄ mM, 1,2 mM _de KH 2 PO _4, glicose 20 mM, 1,5 mM de CaCl _{2 .2H} 2 O, pH = 7,2). Prepara-se uma seringa de 5 mL com uma agulha de 21G estéril com solução de KCl (100 mM).
2. Preparar 65 ml de meio por coração: DMEM suplementados com 10% de Soro Fetal de Vitela, antibiótico / antimicótico (A / A; 100 unidades de penicilina, 100 ug de estreptomicina, e 0,25 ug de anfotericina B / ml), insulina-Transferrin-O selénio (STI; 10 ug / ml de insulina, 5,5 ng / ml de transferrina, 6,7 ng / ml de selenito de sódio) e esterilizar filtro.
3. Esterilizar a câmara de perfusão e de retenção de bolhas por pulverização com 70% de etanol e seco com uma toalha de papel. Montar o MTCS (Figura 1D), no entanto, inicialmente sem a câmara de perfusão. Posicione a armadilha de bolhas no stand. Use uma bomba de roletes com cabeças de bomba peristáltica fácil de carga.
   1. Usando tubo flexível de silicone fazer ligações entre o reservatório (tubo de 50 ml) e a bomba, a bomba e a armadilha de bolhas, o borbulhador e reservatório (ver Figura 1D). Adicione a tubagem no interior da incubadora o tempo suficiente para permitir que forma a atingir o equilíbrio de gás com o gás na incubadora através da tubagem de gás permeável de silício (1 M) e o tubo exterior da incubadora tão curto quanto possível.
4. Encha o tubo de 50 ml com etanol 70%, ligar a bomba (velocidade de fluxo de cerca de 1 ml / min para permitir a circulação adequada) e deixar o cir etanolcular por 30 min para esterilizar toda a tubulação. Remover o etanol por esvaziamento do reservatório e bombeando o etanol a partir do sistema.
5. Encha o tubo de 50 ml com água destilada estéril, ligar a bomba e deixe a água circule durante 30 minutos para se livrar do restante etanol. Remover a água por esvaziamento do reservatório e a bombear a água para fora do sistema.
6. Encha o tubo de 50 ml com 45 ml de meio, coloque o suporte na incubadora. Ligue o (velocidade de fluxo de cerca de 1 ml / min) e a bomba faz circular o meio para preencher toda a tubagem, remover todas as bolhas de ar e permitir que a forma para se adaptar à composição do gás na incubadora durante pelo menos 1 h. Manter a incubadora a condições-padrão de cultura de tecidos (5% CO ₂ e 37 ° C). Assegure-se que não há bolhas de ar na tubagem.

2. Isolamento de rato coração

1. Injectar o mouse com 500 unidades de heparina. Isto irá evitar a coagulação do sangue e permite a remoção de bLood a partir do coração. Após 10 min, anestesiar o rato numa câmara de indução com 4% de isoflurano utilizando um vaporizador de precisão. A anestesia é suficiente quando o mouse não responde aos pés pitada.
2. Transferir o rato para uma placa de dissecção e manter a anestesia por meio de uma máscara ligada a um circuito coaxial. Desinfectar a pele do rato com 70% de álcool. Com uma tesoura de abrir a cavidade abdominal para expor a veia cava e diafragma.
3. Para expor o coração, fazer incisões laterais a partir da última para a primeira costelas e refletem a caixa torácica sobre a cabeça de rato. Pare a anestesia como mouse não está respirando mais. Observe o coração batendo.
4. Inserir a agulha 21G ligada a uma seringa de 5 ml estéril contendo tampão de Tyrode para a veia cava inferior do abdominal para dentro da cavidade torácica (através do diafragma). Certifique-se de que o sangue pode sair da veia cava caudal a partir da inserção da agulha. Perfundir thTampão de Tyrode e suavemente e com uma pressão constante para a veia cava até que o coração perde parcialmente a sua cor vermelha. Nota: o coração permanece a bater, permitindo a remoção do sangue a partir do coração.
5. Substituir a agulha com a agulha 21G ligada a uma seringa de 5 ml contendo solução de KCl estéril. Suavemente perfundir a solução de KCl para a veia cava até o coração parar de bater e remover a agulha. Nota: A solução de KCl preserva o coração na fase diastólica relaxada, o que vai permitir uma inserção mais fácil das agulhas de perfusão e do sistema de perfusão coronária.
6. Levante ligeiramente o coração usando uma pinça curva e usando uma tesoura dissecar o coração livre do tecido circundante, mas deixar artérias e veias proximais ao coração intactos e anexado ao coração. Transferir o coração para um tubo de 15 ml contendo PBS arrefecido em gelo suplementado com antibiótico / antimicótico (A / D). Armazenar o coração em PBS gelado por até 3 horas.

3. Cannulation dos corações mouse na câmara de perfusão

1. Efectuar todos os procedimentos em capela de fluxo laminar. Transferir o coração isolado a partir do tubo de 15 ml a um prato de 10 cm de Petri e adicionar PBS suplementado com A / A.
2. Sob um microscópio de dissecação, o uso de tesoura e micro fórceps para remover todo o tecido cardíaco, mas não preservar a aorta ascendente, pelo menos, da bifurcação com a artéria inominada e as veias pulmonares, 2 mm proximal ao coração. Cortar a extremidade da ponta do coração para criar um acesso para o lúmen do ventrículo esquerdo (tipicamente 2 mm). Coloque a câmara de perfusão em câmara de fluxo a sob o microscópio de dissecação.
3. Anexar uma seringa de 5 ml com meio à agulha de inserção usando o tubo de silicone. Encher a câmara de perfusão com 20 ml de meio e colocar o coração no estágio de rotação entre as agulhas embotadas 2 na câmara de perfusão (Figura 1). Ajustar a altura da fase de rotação de modo que o coração está posicionada em frente doagulhas.

4. A ligadura para a cultura das valva mitral (ver figura 1)

1. Ligadura da aorta com sutura (seda 7.0). Ligadura do apêndice atrial esquerdo com sutura. Insira a agulha (nr. 1 na Figura 1) através da veia pulmonar para o átrio esquerdo e ligar com sutura proximal à sua entrada no átrio esquerdo. Certifique-se de que a agulha não é muito longe para o átrio esquerdo, pois isso iria danificar a válvula mitral.
2. Inserir a agulha (nr.2 na Figura 1) com um movimento linear para o ventrículo esquerdo. Transferir o meio a partir da câmara de perfusão para um tubo de 50 ml. Selar a agulha para o miocárdio com cola biocompatível.
3. Depois que a cola secar, injetar cuidadosamente em meio coração, ligando uma seringa cheia de médio a agulha nr.1 e verifique se há algum vazamento. Assegurar que as saídas médias de nr.2 agulha eo último sangue restante é perfundido para fora do coração.

5. Ligação para a cultura das Válvula Aórtica (veja a Figura 1)

1. Inserir a agulha (nr.1 na Figura 1) na aorta e ligar com sutura. Certifique-se de que a agulha não é muito longe para a aorta como isso iria danificar a válvula aórtica. Inserir a agulha (nr.2 na Figura 1) com um movimento linear para o ventrículo esquerdo. Transferir o meio a partir da câmara de perfusão para um tubo de 50 ml. Selar a agulha para o miocárdio com cola biocompatível.
2. Depois que a cola secar, injetar cuidadosamente médio para o coração, ligando uma seringa cheia de médio a agulha nr.2 e verifique se há algum vazamento. Assegurar que as saídas médias de nr.1 agulha eo último sangue restante é perfundido para fora do coração.

6. Coloque Perfusão Secção de suporte

1. Encha câmara de perfusão com os 20 ml de meio transferidos. Coloque a junta e tampa na câmara e aperte com lavadora e parafusos.
2. Remova os MTCS montados a partir do incubator. Fixe a câmara de perfusão no stand. Conecte o tubo (veja a Figura 1D). Colocar o suporte na incubadora (5% de CO ₂ e 37 ° C). Conecte a tubulação à bomba. Ligue a bomba com velocidade de fluxo de cerca de 600 mL / min.
3. Certifique-se de que no reservatório e / ou o borbulhador o nível do meio permite que as visualizações da presença do fluxo pela queda das gotas médias de entrada. Após a cultura, o coração é removido do sistema, fixadas e processadas para exame histológico.

Resultados

A válvula da aorta (Figura 2) da válvula mitral ou ¹¹ podem ser cultivadas por pelo menos 3 dias. Através da cultura na posição aberta (que representa a posição sistólica para a válvula aórtica diastólica e a posição da válvula mitral para a), as células permanecem viáveis ​​valvulares. Não é observada a morte celular como determinado pela ausência de células de TUNEL positivo (Figura 2H, I) ou clivado expressão da caspase-3 (não mostrado e Lieber

Discussão

As etapas críticas em cultura das válvulas cardíacas de rato incluem fazer o tempo entre a excisão do coração do rato e a ligação na câmara de perfusão tão curto quanto possível, para assegurar a viabilidade e ligação das agulhas perpendicular às válvulas para assegurar a direcção correcta de fluxo . Além disso, a verificação do fluxo após a ligadura na câmara de perfusão sem forma garante uma inserção correcta e ligadura de agulhas. É essencial para manter uma cultura estéril e evitar bolhas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	life technolgies	10569-010
Fetal Bovine Serum	life technolgies	26140
Insulin-Transferrin-Selenium	life technolgies	41400-045
Antibiotic-Antimycotic	life technolgies	15240-06
Silk 7-0	Ethicon	768G
100 mm culture dish	Greiner bio-one	664160
50 ml tube	Greiner bio-one	227261
5 ml syringe	BD	309649
21 G needle	BD	304432
Heparin	LEO	012866-08
Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	Tedpella	1346
Silicon tubing	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
Silicon tubing for pump	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm
Biocompatible glue (Histoacryl)	B. Braun	1050071
precision vaporizer	Dräger	Vapor 200
peristaltic roller pump	Masterflex	7521-35
Easy-load pump head	Masterflex	7518-00
Flow chamber			see Lieber et al., 2010
Bubble trap			see Lieber et al., 2010