Культивирование мыши сердечных клапанов в миниатюре культуры тканевой системе

Резюме

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Аннотация

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.

Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.

In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

Введение

Болезнь сердца клапан является основной причиной заболеваемости и смертности в западном мире; его распространенность увеличивается с возрастом, и это влияет на более чем 10% населения 75 лет и старше ^1. Клапаны системной части сердца, аортального и митрального клапанов, в основном пострадали. Сердечно-сосудистые заболевания клапанов характеризуется потерей высокоорганизованной структуре клапанов, что приводит к изменению механических свойств ^2. Структурная целостность Поэтому крайне важно для функции клапана.

Створки клапана состоят из клапанов интерстициальных клеток (ВМЦ), клапанов эндотелиальных клеток (VEC), и внеклеточного матрикса, который высоко организованной в слоистой рисунком ^3,4. ВИК отвечают за синтез ЕСМ, деградации и организации. Факторы, исходящий из крови, ЭК или проживающих в ECM действуют на ВИНК оркестровки свою функцию. В дополнение,механические силы действуют на листовке во время сердечного цикла, в результате чего ламинарный или колебательного напряжения сдвига, сжатия или растягивающих напряжений, влияющих на поведение ВИНК ^5.

Для того, чтобы понять, как структура клапана регулируется, то сначала следует понимать, как ВИНК реагировать на разнообразный набор стимулов опытных во время сердечного цикла. В пробирке исследования были очень информативными о характеристиках и способностях клапанов клеток. Реакция этих клеток в пробирке, однако, может не всегда точно имитировать ответ в естественных условиях ^6; Например, реакция на раздражители VIC зависит от наличия ЭК и ECM состава ^5. Кроме того, реакция клапанного клеток на стимулы, зависит от их конкретного места в листовке ^7. В дополнение к биохимических раздражителей, поведение клапанных элементов определяется механическими силами, действующими Oп ^клапан 8. Каждая область клапана подвергается ее собственный набор гемодинамических нагрузок. Хотя нынешние экс естественных условиях модели показали, что механические силы являются важными факторами, определяющими структуру клапанов ^5, связанные механизмы до сих пор неясно. В то время как модели в естественных условиях обеспечили понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе развития клапанной ^9,10, способность проникновения в суть взрослых клапанной биологии до сих пор не удается.

Таким образом, экс виво модель потока была разработана в котором клапаны сердца могут быть культивированы в их естественном положении в центре в течение длительного периода времени ^11. Это имеет то преимущество, что клапаны остаются в их естественной конфигурации и ИКС испытать ту же среду, что и в естественных условиях, что делает ответов на стимулы VICS как можно более естественным. Кроме того, культура клапанов в их естественном положении в центре облегчает подвергая другклапанов регион соответствующих гемодинамики напряжений. В этом экс виво модели, т.е. Миниатюрный культуры ткани Система (MTCS), клапаны могут быть подвергнуты различным биохимическим и гемодинамических стимулов, позволяющих исследование их роли в ремоделирования сердца клапана.

протокол

Этот протокол следует рекомендациям LUMC животного исследования Комитетом по этике.

1. Подготовка инструментов, культура средний и MTCS

Примечание: Выполните все препараты в ламинарный. MTCS перфузии камера, пузырь ловушку и стенд описаны в Либер и др., 2010 ^11.

1. Лечить щипцы и ножницы с микро 70% этанола. Подготовьте 5 мл шприц с 21G иглу стерильной Тирода буфера (130 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 6,0 мМ Hepes, 1,2 мМ MgSO _4, 1,2 мМ KH _{2 PO 4, 20} мМ глюкозы, 1,5 мМ CaCl ₂ · 2H _{2 O,} рН = 7,2). Подготовка 5 мл шприц с иглой 21G с стерильного раствора KCl (100 мм).
2. Подготовка 65 мл среды на основе DMEM: с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотиками / противогрибковое (A / A; 100 единиц пенициллина, 100 мкг стрептомицина и 0,25 мкг амфотерицина / мл), инсулин-Transferrin-Селен (ИТС; 10 мкг / мл инсулина, 5,5 мкг / мл трансферрина, 6,7 нг / мл селенит натрия) и фильтр стерилизуют.
3. Стерилизовать перфузии камеры и пузырь ловушку путем распыления 70% этанола и сухой с бумажным полотенцем. Собирают MTCS (рис 1D), однако, вначале без перфузии камеры. Расположите пузырь ловушку на стенде. Используйте перистальтического роликового насоса с головок насоса легко нагрузки.
   1. Использование кремния трубки сделать связи между резервуаром (50 мл) и трубки насоса, насоса и пузырь ловушку, ловушку пузыря и водохранилища (рис 1D). Сделать трубки внутри инкубатора достаточно долго, чтобы позволить достичь средней газа равновесии с газовой в инкубаторе через проницаемую трубки газовой кремния (1 М) и трубки вне инкубатора как можно короче.
4. Заполните 50 мл пробирку с 70% -ным этанолом, включить насос (скорость потока примерно 1 мл / мин, чтобы позволить циркуляцию), и пусть этанол CIRculate в течение 30 мин, чтобы стерилизовать все трубки. Удаления этанола путем опорожнения резервуара и откачки этанола из системы.
5. Заполните 50 мл трубку стерильной дистиллированной водой, включить насос и дайте воде циркулировать в течение 30 мин, чтобы избавиться от оставшихся этанола. Удалить воду опорожнения резервуара и откачки воды из системы.
6. Заполните 50 мл трубку с 45 мл среды, поставить стенд в инкубатор. Включите (скорость потока приблизительно 1 мл / мин) насос и циркулировать среда, чтобы заполнить все трубки, удалить все пузырьки воздуха и позволяют среда для адаптации к составу газа в инкубаторе в течение 1 ч. Поддерживать инкубатор при стандартных условиях культивирования тканей (5% СО ₂ и 37 ° С). Убедитесь, что не было пузырей присутствуют в трубке.

2. Выделение мыши Сердце

1. Вводите мышь с 500 единиц гепарина. Это позволит предотвратить свертывание крови и позволяет удаление бLOOD от сердца. Через 10 мин анестезию мыши в индукционной камере с 4% изофлуран использованием прецизионного испаритель. Анестезия достаточно, когда мышь не отвечает на носок щепотку.
2. Передача мышь, чтобы рассечение борту и поддерживать анестезию с помощью лицевой маски, подключенного к коаксиальному цепи. Лечить мех мыши с 70% алкоголя. Использование ножницы вскрыть брюшную полость, чтобы разоблачить полую вену и диафрагму.
3. Чтобы разоблачить сердце, сделать боковые разрезы, начиная от последнего к первому ребер и отражают грудной клетки над головой мыши. Остановите анестезии, как мыши не дышит больше. Соблюдайте биение сердца.
4. Вставьте иглу 21G, прикрепленный к 5 мл шприца, содержащего буфер стерильного Тирода в нижней полой вене из брюшной в грудную полость (через мембрану). Убедитесь, что кровь может выйти из вены хвостовой полой от введения иглы. Заливать йБуфер е Тирода мягко и с постоянным давлением в полую вену, пока сердце не теряет частично свою красного цвета. Примечание: Сердце бьется остается позволяя удаление крови из сердца.
5. Замените иглу с иглой 21G 5 мл шприц, содержащий стерильный раствор KCl. Осторожно заливать раствор KCl в полой вены, пока сердце не перестанет биться и извлеките иглу. Примечание: Решение KCl сохраняет сердце в непринужденной диастолическую фазу, которая позволит легче вставлять перфузии игл и перфузии коронарных системы.
6. Слегка приподнимите сердце с помощью изогнутых щипцов и с помощью ножниц препарировать сердце свободно от окружающих тканей, но оставить артерии и вены проксимальных к сердцу целости и прилагается к сердцу. Перенести сердце 15 мл пробирку, содержащую ледяной PBS с добавлением антибиотиков / противогрибковое (A / A). Храните сердце в ледяной PBS до 3 часов.

3. Cannulatioп мыши сердец в перфузии палаты

1. Выполните все процедуры в ламинарный. Передача изолированного сердца от 15 мл трубку в чашку Петри 10 см и добавить ФБР с добавкой A / A.
2. Под микроскопом рассекает, используйте микро ножницы и пинцет, чтобы удалить все не-сердечной ткани, но сохранить восходящую аорту, по крайней мере бифуркации с брахиоцефальных артерий и легочных вен, 2 мм проксимальнее сердца. Отрежьте кончик верхушки сердца, чтобы создать доступ к левого желудочка просвет (обычно 2 мм). Поместите камеру перфузии в капюшоне потока под микроскопом рассекает.
3. Приложить 5 мл шприц с среды к вставке иглы с помощью силиконовых трубок. Заполните перфузии камеру с 20 мл среды и положил сердце на сцене вращения между 2 притупляются иглы в перфузии камеры (рисунок 1). Высоту стадии вращения так сердце позиционируется в передней частииглы.

4. Лигирование для культивирования митрального клапана (рисунок 1)

1. Перевязывать аорты с шелковой нити (7,0). Перевязывать ушка левого предсердия с швом. Вставьте иглу (номер факса. 1 на рисунке 1) через легочную вену в левом предсердии и перевязывать с шовного проксимального его вступления в левом предсердии. Убедитесь, что игла находится не слишком далеко в левое предсердие, так как это приведет к повреждению митрального клапана.
2. Вставьте иглу (nr.2 на рисунке 1) с линейным движением в левый желудочек. Передача среды из камеры перфузии в 50 мл пробирку. Печать иглу в миокарде с биосовместимого клея.
3. После высыхания клея, тщательно вводить среду в сердце, подключив средний заполненный шприц с иглой nr.1 и проверить, если есть какие-либо утечки. Убедитесь, что средний выход из иглы nr.2 и последний оставшийся в крови перфузии из сердца.

5. Лидование для культивирования аортального клапана (рисунок 1)

1. Вставьте иглу (Nr.1 на рисунке 1) в аорте и перевязывать с швом. Убедитесь, что игла находится не слишком далеко в аорту, так как это приведет к повреждению аортального клапана. Вставьте иглу (nr.2 на рисунке 1) с линейным движением в левый желудочек. Передача среды из камеры перфузии в 50 мл пробирку. Печать иглу в миокарде с биосовместимого клея.
2. После высыхания клея, тщательно вводить среду в сердце, подключив средний заполненный шприц с иглой nr.2 и проверить, если есть какие-либо утечки. Убедитесь, что средний выход из иглы nr.1 и последний оставшийся в крови перфузии из сердца.

6. Место перфузии палаты на стенде

1. Заполните перфузии камеру с 20 мл переданных среду. Поместите прокладку и крышку на камеру и затяните с шайбой и винтами.
2. Удалить собранные MTCS из ИнкубаторыTor. Прикрепите перфузии камеры на стенде. Подключите трубки (рис 1D). Поместите подставку в инкубаторе (5% CO ₂ и 37 ° C). Подключите шланг к насосу. Включите насос со скоростью потока около 600 мкл / мин.
3. Убедитесь, что в резервуаре и / или пузырьков ловушку уровень среды позволяет визуализации присутствии потока при падении из входящих капель среды. После культивирования, сердце удаляется из системы, фиксированной и обработаны для гистологического исследования.

Результаты

Аортального клапана (фиг.2) или митрального клапана ¹¹ можно культивировать в течение по крайней мере 3 дней. Культивированием в открытом положении (которое представляет собой систолическое положение для аортального клапана и диастолического положении для митрального к?...

Обсуждение

Критические шаги в культивировании клапаны мыши сердечные включают создание времени между удалением сердца от мыши и лигирование в перфузионной камеры как можно короче, чтобы обеспечить жизнеспособность и лигирование иглы перпендикулярно к клапанам, чтобы обеспечить надлежащее нап...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	life technolgies	10569-010
Fetal Bovine Serum	life technolgies	26140
Insulin-Transferrin-Selenium	life technolgies	41400-045
Antibiotic-Antimycotic	life technolgies	15240-06
Silk 7-0	Ethicon	768G
100 mm culture dish	Greiner bio-one	664160
50 ml tube	Greiner bio-one	227261
5 ml syringe	BD	309649
21 G needle	BD	304432
Heparin	LEO	012866-08
Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	Tedpella	1346
Silicon tubing	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
Silicon tubing for pump	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm
Biocompatible glue (Histoacryl)	B. Braun	1050071
precision vaporizer	Dräger	Vapor 200
peristaltic roller pump	Masterflex	7521-35
Easy-load pump head	Masterflex	7518-00
Flow chamber			see Lieber et al., 2010
Bubble trap			see Lieber et al., 2010