Minyatür Doku Kültürü Sistemde Fare Kalp Vanalar Kültürleme

Özet

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Özet

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.

Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.

In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

Giriş

Kalp kapak hastalığı, Batı dünyasında morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir; prevalansı yaşla birlikte artar ve nüfus 75 yıldan fazla% 10 ve ¹ yaşlı etkiler. Kalbin sistemik kısmının vanalar, aort ve mitral vanalar, en çok etkilenen bulunmaktadır. Kalp kapakçığı hastalığı mekanik özellikleri ² değişmesi ile sonuçlanır valf yüksek organize yapı kaybıyla karakterizedir. Yapısal bütünlük valfi işlevi açısından kritiktir.

Vana bildiriler kapak interstitial hücrelerin (VIC), kapak endotel hücreleri (VEC) ve yüksek bir tabakalı desen ^3,4 düzenlenen hücre dışı matris oluşur. Kurbanlar ECM sentezi, yıkımı ve organizasyon sorumludur. Faktörler kan dolaşımına, EC kaynaklanan veya fonksiyonlarını düzenlediğini kurban ECM hareket ikamet eden. Ek olarak,mekanik kuvvetler Laminer veya salınımlı kayma gerilmesi, kurban ⁵ davranışını etkileyen basınç veya çekme gerilmeleri sonucu kardiyak döngüsü sırasında broşür hareket.

Vananın yapısı nasıl düzenlendiği anlamak için, öncelikle kurban kardiyak döngüsü sırasında yaşanan uyaranların farklı setine nasıl yanıt anlaşılması gerekir. In vitro çalışmalar, kapak hücrelerinin özellikleri ve yetenekleri hakkında çok bilgilendirici olmuştur. Bu hücrelerin in vitro yanıtı, ancak, her zaman doğru bir in vivo yanıt ⁶ taklit olmayabilir; örneğin, uyaranlara VIC tepki EC varlığı ve ECM bileşimin ⁵ bağlıdır. Ayrıca, uyaranlara kapak hücrelerinin tepki broşürü ⁷ onların belirli bir konuma bağlıdır. Biyokimyasal uyaranlara ek olarak, kapak hücrelerinin davranışı o hareket mekanik kuvvetlerin belirlenirn ^valfi 8. Vananın Her bölgenin hemodinamik gerilmelerin kendine özgü kümesine tabi tutulur. Geçerli ex vivo modeller mekanik kuvvetler kapak yapısının ⁵ önemli belirleyicileri olduğunu göstermiştir rağmen, ilgili mekanizmalar hala belirsiz. In vivo modeller kapak gelişimini ^9,10 altında yatan moleküler mekanizmaları içgörü sağladı ederken, yetişkin kapak biyoloji içine anlayışlar hala zor olduğunu.

Bu nedenle, bir ex vivo akış modeli olan kalp valfleri zaman ¹¹ arasında bir süre için merkezinde kendi doğal pozisyonunda kültürlenebilir geliştirilmiştir. Bu valfler doğal konfigürasyonda kalır ve kurban mümkün olduğunca doğal uyaranlara karşı yanıt kurban yapım in vivo aynı ortamı deneyim avantajına sahiptir. Buna ek olarak, kalbinde doğal pozisyonda vanaların kültürü her tabi kolaylaştırırİlgili hemodinamik gerilimlere kapak bölgesi. Örneğin, bu ex vivo modelde, Minyatür Doku Kültür Sistemi (MTCS), valfler kalp kapağı yeniden rolleri incelenmesi sağlayan farklı biyokimyasal ve hemodinamik uyaranlara maruz bırakılabilir.

Protokol

Bu protokol, hayvan araştırma etik komitesinin LUMC kuralları izler.

Araçların 1. Hazırlık, kültür ortamı ve MTCS

Not: laminer akış kaputu tüm hazırlıklarını yapın. MTCS perfüzyon odasına, kabarcık kapanı ve tek Lieber ve diğ., ^{2010, 11} tarif edilmiştir.

1. % 70 etanol ile forseps ve mikro makas dezenfekte edin. Steril Tyrode tamponu (130 mM NaCI, 5.4 mM KCI, 6.0 mM Hepes ve 1.2 mM MgSO _4, 1.2 ile 21G iğne ile 5 ml şırınga hazırlayın mM KH ₂ PO _4, 20 mM Glükoz, 1,5 _mM CaCl2 .2H _2, O, pH = 7.2). Steril KCI çözeltisi (100 mM) ile, 21G iğne ile 5 ml şırınga hazırlayın.
2. 65 kalp başına ortam ml hazırlayın: (A / A, penisilin 100 birim, 100 ug streptomisin ve amfoterisin B 0.25 ug / ml) DMEM,% 10 fetal dana serumu, antibiyotik / antimikotik ile desteklenmiş İnsülin transferinSelenyum (ITS; / ml insülin 10 ug, 5.5 ug / ml Transferin, 6.7 ng / ml sodyum selenit) ve filtre sterilize.
3. % 70 etanol ve kağıt havluyla kurulayın sıkarak perfüzyon odası ve kabarcık tuzak sterilize edin. Başlangıçta perfüzyon odasının olmadan, ancak, MTCS (Şekil 1D) birleştirin. Stand kabarcık tuzak yerleştirin. Kolay yükleme pompası başkanları ile bir peristaltik roller pompa kullanın.
   1. Silikon boru rezervuar (50 ml tüp) ve pompa, pompa ve kabarcık kapanı, kabarcık kapanı ve rezervuar arasındaki bağlantıları (Şekil 1D bakınız) yapmak kullanma. Orta gaz geçirgen silikon tüp (1 m) ve mümkün olduğunca kısa inkübatör dışına tüp aracılığıyla inkübatör gazıyla gaz dengeye ulaşması için izin yeterince uzun inkübatör içinde boru yapın.
4. (Düzgün dolaşım sağlamak için / 1 ml civarında dk akış hızı) pompa açmak,% 70 etanol ile 50 ml tüp doldurun ve etanol CIR izinTüm boru sterilize etmek için 30 dakika boyunca hesaplanmalıdır. Rezervuar boşaltma ve sistemden etanol dışarı pompalama yoluyla etanol çıkarın.
5. Steril distile su ile 50 ml tüp doldurun pompa açmak ve 30 dakika boyunca su sirküle etanol kalan kurtulmak için izin verin. Rezervuar boşaltma ve sistemden suyu pompalanarak suyunu çıkartın.
6. Orta 45 ml, 50 ml tüp doldurun, inkübatör standı koymak. Pompa (1 ml / dakika akış hızı yaklaşık) açın ve tüm boruların doldurmak için orta sirküle, tüm hava kabarcıklarını çıkarmak ve orta en az 1 saat boyunca kuluçka makinesi içinde, gaz bileşimine uyum sağlar. Standart doku kültürü koşullarında (% 5 _CO2 ve 37 ° C) kuluçka tutun. Hiçbir kabarcıklar tüp mevcut olduğundan emin olun.

Fare Heart 2. izolasyonu

1. Heparin 500 adet fare ile enjekte edilir. Bu pıhtılaşma kan önlemek ve b kaldırılmasını sağlar olacakkalp LOOD. 10 dakika sonra, hassas bir buharlaştırıcı kullanılarak% 4 izofluran ile bir indüksiyon odasında fare anestezi. Fare ayak tutam tepkisiz olduğunda anestezi yeterlidir.
2. Bir diseksiyon kurulu fareyi aktarın ve koaksiyel devresine bağlı bir yüz maskesi vasıtasıyla anestezi korumak. % 70 alkol ile fare kürk dezenfekte edin. Makas karın boşluğuna açılması kullanma vena kava ve diyaframı ortaya çıkarmak.
3. , Kalp maruz geçen ilk kaburga başlayan yanal kesiler yapmak ve farenin başının üzerinde göğüs kafesi yansıtacak. Fare artık nefes almıyorsa olarak anestezi durdurun. Kalp atışını gözlemleyin.
4. (Diyafram üzerinden) göğüs boşluğuna karın gelen inferior vena kava içine steril Tyrode Tamponu içeren 5 ml şırınga bağlı 21G iğne takın. Kan iğne yerleştirilmesi gelen vena kava kaudal çıkabilirsiniz emin olun. Inci serpmeke Tyrode Tampon nazikçe ve vena kava içine sabit basınç kalp kısmen kırmızı rengini kaybeder kadar. Not: Kalp kalpten kanın çıkarılmasını sağlayan yenerek kalır.
5. Steril KCI çözeltisi ihtiva eden bir 5 ml şırıngaya bağlanmış 21G iğne ile iğne değiştirin. Yavaşça kalp atışını durana kadar vena kava içine KCl çözeltisi serpmek ve iğneyi çıkartın. Not: KCl çözümü koroner sistemin daha kolay perfüzyon iğne yerleştirilmesi ve perfüzyon sağlayacak rahat diyastolik aşamasında kalbi korur.
6. Hafif kavisli bir forseps kullanarak kalbi kaldırın ve makas kullanarak kalp sağlam ve kalbe bağlı proksimal arter ve venler çevreleyen dokudan serbest kalbini incelemek ama bırakın. Buz soğukluğunda PBS antibiyotik / antimikotik (A / A) ile desteklenmiş ihtiva eden bir 15 ml tüp kalp aktarın. Kadar 3 saat boyunca buz soğukluğunda PBS kalp saklayın.

3. CannulatioPerfüzyon Odası Fare Kalpler n

1. Laminer akış kaputu tüm prosedürleri uygulayın. 10 cm'lik Petri kabı 15 ml tüp izole kalbi aktarın ve eklemek PBS A / A ile desteklenmiş.
2. Bir mikroskop altında, tüm non-kardiyak doku kaldırmak için mikro makas ve forseps kullanabilir ancak artan aorta korumak kalbe brakiyosefalik arter ve pulmoner venlerin, 2 mm proksimal en az çatallanma için. Sol ventrikül lümen (tipik olarak 2 mm) erişim temin etmek kalbin üst ucu kesin. Diseksiyon mikroskobu altında akış kaputu perfüzyon odasına yerleştirin.
3. Silikon tüp kullanılarak uç iğneye orta ile 5 ml şırınga takın. 20 ml ortam ile perfüzyon odasına doldurun ve perfüzyon odasında 2 körelmiş iğneler (Şekil 1) arasındaki dönme sahneye kalbini koydu. Kalp önüne konumlandırılmış böylece dönme aşamasında yüksekliğini ayarlayıniğne.

Mitral Vana Kültürleme 4. ligasyonu (Şekil 1)

1. Sütür (ipek 7.0) ile aort Arter. Sütür ile sol atriyal apendiks Arter. Sol atriyuma pulmoner ven yoluyla (Şekil 1'de. 1 nr) iğne takın ve sol atrium onun giriş sütür proksimal ile Arter. Bu mitral kapak zedeleyecek şekilde iğne sol atrium içine çok uzak değil emin olun.
2. Sol ventrikül içine doğrusal hareket ile iğne (Şekil 1 'de No.2) yerleştirin. 50 ml'lik bir tüpe perfüzyon odasından gelen orta aktarın. Biyouyumlu yapıştırıcı ile miyokardiyuma iğne Seal.
3. Tutkal kuruduktan sonra dikkatlice nr.1 iğne ve herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için bir orta dolu şırıngayı bağlayarak kalp içine orta enjekte. İğne Nr.2 ve son kalan kan kalbin dışına perfüze o orta çıkar olun.

5. LiAort Vana Kültürleme için Navigasyon (Şekil 1)

1. Aort iğne (Şekil 1 'de No.1) takın ve sütür ile ligate. Bu aort kapağını zedeleyecek şekilde iğne aort içine çok uzak değil emin olun. Sol ventrikül içine doğrusal hareket ile iğne (Şekil 1 'de No.2) yerleştirin. 50 ml'lik bir tüpe perfüzyon odasından gelen orta aktarın. Biyouyumlu yapıştırıcı ile miyokardiyuma iğne Seal.
2. Tutkal kuruduktan sonra dikkatlice Nr.2 iğne ve herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için bir orta dolu şırıngayı bağlayarak kalp içine orta enjekte. İğne nr.1 ve son kalan kan kalbin dışına perfüze o orta çıkar olun.

Stand 6. Perfüzyon Odası

1. Orta aktarıldı 20 ml perfüzyon odasına kadar doldurun. Odasının üzerine conta ve kapak yerleştirin ve pul ve vida ile sıkın.
2. Incuba monte MTCS kaldırtor. Stand perfüzyon odasına takın. Boru bağlayın (Şekil 1D bakınız). Inkübatör (% 5 _CO2 ve 37 ° C) 'de standı yerleştirin. Pompanın hortumu bağlayın. 600 ul / dk etrafında akış hızı ile pompa açın.
3. Rezervuar ve / veya kabarcık kapanı orta düzey gelen orta damlaların düşerek akışının varlığı görselleştirme izin verdiğinden emin olun. Kültürden sonra, kalp, sistemden çıkarılır fikse edilmiş ve histolojik inceleme için işlenir.

Sonuçlar

Aort kapak (Şekil 2) ya da mitral kapak ^11, en ​​az 3 gün süre ile kültüre edilebilir. (Aort kapağı ve mitral kapağın diyastolik pozisyon için sistolik konumu temsil) açık konumdayken kültürleme yoluyla, kapak hücreleri canlı kalır. TÜNEL-pozitif hücreleri (Şekil 2H, I) veya ayrıldı kaspaz-3 yokluğu ile belirlendiği gibi Resim hücre ölümü gözlenir (gösterilmemiştir olup Lieber ve diğ., 2010 ^11). (Masson ...

Tartışmalar

Kalp fare vanaları kültürleme Kritik adımlar akış yönünü doğru sağlamak için fare kalbin eksizyonu ve vanalar dik iğne canlılığını ve ligasyonu sağlamak mümkün olduğunca kısa perfüzyon odasında ligasyon arasındaki süre yapım dahil . Ayrıca, orta olmadan perfüzyon odasında bağlanmasından sonra akışını kontrol uygun ekleme ve iğneler bağlanmasını sağlar. Bu steril kültür korumak ve potansiyel akış tıkayan kalbinde sıkışıp alabilir boru, hava kabarcıklarını engellemek i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	life technolgies	10569-010
Fetal Bovine Serum	life technolgies	26140
Insulin-Transferrin-Selenium	life technolgies	41400-045
Antibiotic-Antimycotic	life technolgies	15240-06
Silk 7-0	Ethicon	768G
100 mm culture dish	Greiner bio-one	664160
50 ml tube	Greiner bio-one	227261
5 ml syringe	BD	309649
21 G needle	BD	304432
Heparin	LEO	012866-08
Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	Tedpella	1346
Silicon tubing	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
Silicon tubing for pump	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm
Biocompatible glue (Histoacryl)	B. Braun	1050071
precision vaporizer	Dräger	Vapor 200
peristaltic roller pump	Masterflex	7521-35
Easy-load pump head	Masterflex	7518-00
Flow chamber			see Lieber et al., 2010
Bubble trap			see Lieber et al., 2010