Kultivierung von Maus-Herzklappen in der Miniatur-Gewebekultursystem

Zusammenfassung

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Zusammenfassung

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.

Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.

In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

Einleitung

Herzklappenerkrankungen ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der westlichen Welt; die Prävalenz steigt mit dem Alter, und es wirkt sich auf mehr als 10% der Bevölkerung 75 Jahre und älter ^1. Die Ventile des systemischen Teil des Herzens, die Aorten- und Mitralklappen Besonders betroffen sind. Herzklappenkrankheit wird durch den Verlust des hochorganisierte Struktur der Ventile, die in der Veränderung der mechanischen Eigenschaften ^{2 Ergebnisse} aus. Die strukturelle Integrität ist daher entscheidend für die Funktion des Ventils.

Die Blättchen des Ventils sind der Klappen interstitiellen Zellen (VIC), Herzklappen Endothelzellen (VEC) und extrazelluläre Matrix, die besonders in einem geschichteten Muster ^3,4 organisiert besteht. Die VICs sind für den ECM-Synthese, Abbau und Organisation verantwortlich. Faktoren aus dem Blut, ECs ausgeht oder mit Wohnsitz in der ECM wirken auf die VICs Orchestrierung seiner Funktion. Außerdem,mechanische Kräfte auf das Flugblatt wirken während des Herzzyklus, was zu laminaren oder oszillierende Scherbelastung, Druck- oder Zugspannungen Beeinflussung des Verhaltens von VICs ^5.

Um zu verstehen, wie die Struktur des Ventils reguliert wird, muss es zunächst zu verstehen, wie VICs der vielfältigen Anzahl von Einflüssen während des Herzzyklus reagieren könnte. In vitro-Studien haben sehr informativ über die Eigenschaften und Fähigkeiten der Klappenzellen. Die Antwort dieser Zellen in vitro können jedoch nicht immer genau imitieren das in vivo ^Verhalten 6; beispielsweise ist die Reaktion auf Reize VIC abhängig von der Anwesenheit von ECs und ECM-Zusammensetzung ^5. Ferner das Ansprechen der Klappen Zellen auf Stimuli, hängt von ihrer bestimmten Stelle in dem Merkblatt ^7. Neben biochemische Reize wird das Verhalten der Zellen, die durch Klappenbetätigung O mechanische Kräfte bestimmtn ^das Ventil 8. Jeder Bereich des Ventils ist mit ihrem eigenen spezifischen Satz hämodynamische Beanspruchungen ausgesetzt. Obwohl aktuelle Ex-vivo-Modelle haben gezeigt, daß mechanische Kräfte sind wichtige Determinanten ^{Klappenstruktur} 5 sind die zugehörigen Mechanismen noch nicht geklärt. Während in vivo-Modellen haben Einblick in die molekularen Mechanismen Klappenentwicklung ^9,10 zugrunde liegenden vorgesehen ist Einblicke in Erwachsenen Klappen Biologie noch völlig unklar.

Daher wurde ein ex vivo Strömungsmodell entwickelt, in denen die Herzklappen in ihrer natürlichen Position im Herzen für einen längeren Zeitraum ¹¹ kultiviert werden. Dies hat den Vorteil, dass die Ventile bleiben in ihrer natürlichen Konfiguration und VICS erfahren derselben Umgebung wie in vivo, wodurch die VICs Reaktionen auf Reize so natürlich wie möglich ist. Zusätzlich kann die Kultur der Ventile in ihrer natürlichen Position im Herzen ermöglicht Werfen jedesKlappenregion an die zuständigen hämodynamische Beanspruchungen. In dieser ex vivo-Modell, das heißt der Miniatur Gewebekultursystem (MTCS) der Ventile kann auf verschiedene biochemische und hämodynamischen Reize ermöglicht die Untersuchung von deren Rolle im Herzklappen Umbau unterzogen werden.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den LUMC Richtlinien des Tierforschungsethikkommission.

1. Herstellung des Instruments, Kulturmedium und MTCS

Hinweis: Führen Sie alle Vorbereitungen in der Sterilbank. Das MTCS Perfusionskammer, Blasenfalle und Ständer sind in Lieber et al., 2010, ¹¹ beschrieben.

1. Desinfizieren Sie die Zange und Mikro-Schere mit 70% Ethanol. Eine 5 ml-Spritze mit 21G-Nadel mit sterilem Tyrode-Puffer (130 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 6,0 mM Hepes, 1,2 mM MgSO _4, 1,2 mM KH _{2 PO 4,} 20 mM Glucose, 1,5 mM CaCl _{2 · 2H 2} O, pH = 7,2). Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze mit Nadel 21G mit sterilem KCl-Lösung (100 mM).
2. Vorbereitung 65 ml Medium pro Herz: DMEM mit 10% fötalem Kälberserum, Antibiotikum / Antimykotikum ergänzt (A / A; 100 Einheiten Penicillin, 100 ug Streptomycin und 0,25 & mgr; g Amphotericin B / ml), Insulin-Transferrin-Selen (ITS; 10 ug / ml Insulin, 5,5 ug / ml Transferrin, 6,7 ng / ml Natriumselenit) und Filter zu sterilisieren.
3. Sterilisieren Sie die Perfusionskammer und Blasenfalle durch Besprühen mit 70% Ethanol und trocken mit einem Papiertuch. Montieren Sie den MTCS (1D), jedoch zunächst ohne die Perfusionskammer. Positionieren Sie den Blasenfalle auf den Ständer. Verwenden Sie eine peristaltische Rollenpumpe mit Easy-Load-Pumpenköpfe.
   1. Mit Silikonschlauch Verbindungen zwischen dem Reservoir (50 ml Röhrchen) und der Pumpe, die Pumpe und der Blasenfalle, die Blasenfalle und Reservoir (siehe Figur 1D). Stellen den Schlauch im Inkubator lang genug, um mittlere bis Gasgleichgewicht mit dem Gas in dem Inkubator über die gasdurchlässige Silikonschlauch (1 m) und die Rohrleitung außerhalb des Inkubators so kurz wie möglich zu erreichen.
4. Füllen Sie die 50-ml-Röhrchen mit 70% Ethanol, schalten Sie die Pumpe (Fließgeschwindigkeit ca. 1 ml / min, um die ordnungsgemäße Zirkulation zu ermöglichen), und lassen Sie das Ethanol circulate für 30 Minuten, um alle Schläuche zu sterilisieren. Das Ethanol durch Entleeren des Behälters und das Abpumpen des Ethanols aus dem System.
5. Füllen Sie die 50-ml-Röhrchen mit sterilem destilliertem Wasser, schalten Sie die Pumpe und lassen Sie das Wasser zirkulieren für 30 Minuten, um der restlichen Ethanol loszuwerden. Entfernen Sie das Wasser durch das Leeren des Reservoirs und das Abpumpen des Wassers aus dem System.
6. Füllen Sie die 50-ml-Röhrchen mit 45 ml Medium, setzen Sie den Stand im Inkubator. Schalten Sie die Pumpe (Fließgeschwindigkeit ca. 1 ml / min) und leitet das Medium, um alle Schläuche zu füllen, entfernen Sie alle Luftblasen und damit das Medium, um die Gaszusammensetzung in den Inkubator für mindestens 1 Stunde anzupassen. Pflegen Sie den Brutschrank bei Standardgewebekulturbedingungen _(5% CO 2 und 37 ° C). Darauf achten, dass keine Luftblasen in den Schläuchen vorhanden sind.

2. Isolierung von Maus Herz

1. Spritzen Sie die Maus mit 500 Einheiten Heparin. Dadurch wird die Verhinderung der Blutgerinnung und ermöglicht das Entfernen von blood aus dem Herzen. Nach 10 min, betäuben die Maus in einer Induktionskammer, die mit 4% Isofluran unter Verwendung eines Präzisions Verdampfer. Die Anästhesie ist ausreichend, wenn sich die Maus nicht mehr reagiert toe Prise.
2. Übertragen Sie die Maus auf eine Dissektion Bord und Aufrechterhaltung einer Narkose mittels einer Gesichtsmaske mit einem koaxialen Schaltung verbunden. Desinfizieren Sie das Fell der Maus mit 70% Alkohol. Mit einer Schere öffnen Sie die Bauchhöhle der Hohlvene und Zwerchfell zu entlarven.
3. Um das Herz aussetzen, stellen seitliche Einschnitte ausgehend vom letzten zu den ersten Rippen und spiegeln den Brustkorb über Kopf Maus. Stoppen Sie die Anästhesie der Maus wird nicht mehr atmen. Beobachten Sie das Herz schlagen.
4. Einfügen der 21G Nadel in eine 5 ml Spritze mit steriler Tyrode-Puffer in die Vena cava inferior von der Bauch in die Brusthöhle (durch die Membran) befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass Blut aus der Vena Cava caudal von der Nadeleinführung austreten kann. Perfundieren the Tyrode-Puffer schonend und mit konstantem Druck in die Hohlvene hinein, bis das Herz verliert teilweise seine rote Farbe. Hinweis: Das Herz bleibt Pfosten ermöglicht das Entfernen von Blut aus dem Herzen.
5. Ersetzen Sie die Nadel mit der 21G Nadel in eine 5-ml-Spritze mit steriler KCl-Lösung angebracht. Perfundieren vorsichtig die KCl-Lösung in die Hohlvene bis das Herz aufhört zu schlagen, und entfernen Sie die Nadel. Anmerkung: Die KCl-Lösung bewahrt die Herzen in der entspannten diastolischen Phase, die ein leichteres Einsetzen der Perfusion Nadeln und Perfusion der Herzkranzsystem ermöglicht.
6. Heben Sie das Herz mit einer gebogenen Pinzette und mit einer Schere zu sezieren das Herz frei von umgebenden Gewebe aber lassen Arterien und Venen proximal des Herzens intakt und mit dem Herzen verbunden. Übertragen Sie die Herzen in ein 15 ml Röhrchen mit eiskaltem PBS, ergänzt mit Antibiotikum / Antimykotikum (A / A). Lagern Sie das Herz in eiskaltem PBS für bis zu 3 Stunden.

3. Cannulation der Maus Hearts in der Perfusionskammer

1. Führen Sie alle in Sterilbank. Übertragen Sie die isolierten Herzen aus dem 15-ml-Röhrchen mit einer 10 cm Petrischale und fügen PBS, ergänzt mit A / A.
2. Unter einem Binokular, verwenden Sie die Mikro-Schere und Pinzette, um alle nicht-Herzgewebe zu entfernen, aber die Erhaltung der aufsteigenden Aorta, um zumindest die Bifurkation mit dem Truncus brachiocephalicus und die Lungenvenen, 2 mm proximal des Herzens. Entzieht der Spitze der Spitze des Herzens, um den Zugang zu den linksventrikulären Lumen (typischerweise 2 mm) zu schaffen. Legen Sie die Perfusionskammer in der Flow-Haube unter dem Binokular.
3. Bringen Sie ein 5-ml-Spritze mit mittleren bis Einsatzes Nadel mit dem Silikonschlauch. Füllen Sie die Perfusionskammer mit 20 ml Medium, und legte das Herz auf dem Rotationstisch zwischen den 2 abgestumpft Nadeln in der Perfusionskammer (Abbildung 1). Einstellen der Höhe des Rotationsstufe so das Herz vor der positioniertNadeln.

4. Ligation für die Kultivierung der Mitralklappe (siehe Abbildung 1)

1. Ligation der Aorta mit Naht (Seide 7.0). Ligation der linken Herzohr mit Naht. Führen Sie die Nadel (Nr. 1 in Abbildung 1) durch die Lungenvenen in den linken Vorhof und Ligation mit Naht proximal zu seinem Eintritt in den linken Vorhof. Sicherzustellen, dass die Nadel nicht zu weit in den linken Vorhof, da dies die Mitralklappe beschädigen.
2. Führen Sie die Nadel (Nr.2 in Abbildung 1) mit linearer Bewegung in den linken Ventrikel. Übertragung des Mediums aus der Perfusionskammer in ein 50 ml Röhrchen. Verschließen Sie die Nadel auf den Herzmuskel mit biokompatiblen Klebstoff.
3. Nachdem der Leim getrocknet ist, sorgfältig zu injizieren Medium in das Herz durch den Anschluss eines Mediums Spritze zur Nadel nr.1 und prüfen Sie, ob es eine Leckage. Sicherzustellen, dass die Medium tritt aus Nadel nr.2 und die letzte verbleibende Blut aus dem Herzen durchblutet.

5. Ligation zur Kultivierung der Aortenklappe (siehe 1)

1. Führen Sie die Nadel (nr.1 in Abbildung 1) in der Aorta und Ligation mit Naht. Sicherzustellen, dass die Nadel nicht zu weit in die Aorta, wie dies die Aortenklappe beschädigen. Führen Sie die Nadel (Nr.2 in Abbildung 1) mit linearer Bewegung in den linken Ventrikel. Übertragung des Mediums aus der Perfusionskammer in ein 50 ml Röhrchen. Verschließen Sie die Nadel auf den Herzmuskel mit biokompatiblen Klebstoff.
2. Nachdem der Leim getrocknet ist, sorgfältig zu injizieren Medium in das Herz durch den Anschluss eines Mediums Spritze zur Nadel nr.2 und prüfen Sie, ob es eine Leckage. Sicherzustellen, dass die Medium tritt aus Nadel nr.1 und die letzte verbleibende Blut aus dem Herzen durchblutet.

6. Legen Perfusionskammer auf Stand

1. Füllen Sie Perfusionskammer mit den 20 ml-Medium. Zeigen Dichtung und Deckel auf die Kammer und ziehen mit Unterlegscheibe und Schrauben.
2. Entfernen Sie die zusammengebauten MTCS vom Incubator. Befestigen Sie die Perfusionskammer auf den Ständer. Den Schlauch (siehe Abbildung 1D). Setzen Sie den Stand im Inkubator _(5% CO 2 und 37 ° C). Schließen Sie den Schlauch an der Pumpe. Schalten Sie die Pumpe mit Strömungsgeschwindigkeit um 600 & mgr; l / min.
3. Sicherstellen, dass in dem Behälter und / oder die Blasenfalle der Pegel des Mediums ermöglicht die Visualisierungen für das Vorhandensein der Strömung durch das Fallen der eingehenden Mediumstropfen. Nach der Kultivierung wird das Herz aus dem System entfernt, fixiert und für die histologische Untersuchung verarbeitet.

Ergebnisse

Die Aortenklappe (Abbildung 2) oder Mitralklappe ^{11 kann} für mindestens 3 Tage kultiviert werden. Durch Kultivierung in der offenen Stellung (die den systolischen Position für die Aortenklappe und der diastolischen Position für die Mitralklappe darstellt), Herzklappen Zellen lebensfähig bleiben. Kein Zelltod beobachtet, wie durch die Abwesenheit von TUNEL-positiven Zellen (2H, I) oder gespalten Caspase-3-Expression bestimmt (nicht gezeigt, und Lieber et al.,<...

Diskussion

Kritischen Schritte in Züchten der Herz Maus Ventile gehört es, die Zeit zwischen dem Herausschneiden des Herzens von der Maus und der Ligation in der Perfusionskammer so kurz wie möglich, um die Lebensfähigkeit und die Ligation der Nadeln senkrecht zu den Ventilen zu gewährleisten richtige Richtung der Strömung zu gewährleisten . Zusätzlich Überwachen von Durchfluss nach der Ligation in der Perfusionskammer ohne Medium gewährleistet eine ordnungsgemäße Einsetzen und Unterbindung der Nadeln. Es ist kritisch,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	life technolgies	10569-010
Fetal Bovine Serum	life technolgies	26140
Insulin-Transferrin-Selenium	life technolgies	41400-045
Antibiotic-Antimycotic	life technolgies	15240-06
Silk 7-0	Ethicon	768G
100 mm culture dish	Greiner bio-one	664160
50 ml tube	Greiner bio-one	227261
5 ml syringe	BD	309649
21 G needle	BD	304432
Heparin	LEO	012866-08
Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	Tedpella	1346
Silicon tubing	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
Silicon tubing for pump	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm
Biocompatible glue (Histoacryl)	B. Braun	1050071
precision vaporizer	Dräger	Vapor 200
peristaltic roller pump	Masterflex	7521-35
Easy-load pump head	Masterflex	7518-00
Flow chamber			see Lieber et al., 2010
Bubble trap			see Lieber et al., 2010