تقنية التخصيب الأمثل للعزل<em&gt; الفصلاء</em&gt; أنواع الجراثيم من عزلات عينة التربة

Summary

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Abstract

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Introduction

في كل مكان من الأنواع الفصلاء في بيئات التربة يقدم عدد كبير وتنوع فاجات قابلة للعزل من هذه الأنواع من البكتيريا المضيف. أعضاء البكتيري للأسرة Acintobacteriaceae هم أبرز لمسارات تقويضي بهم من تدهور مركبات المتمردة مثل الأترازين ومختلف المبيدات الحشرية ومبيدات الأعشاب الأخرى ^1،2،3. على الرغم وقد تم ذلك معظم الأبحاث باستخدام سلالات البيئية للالفصلاء، العزلات السريرية لهذا جنس وجدت في الدم والبول، والعيون، والعديد من المصادر البشرية الأخرى عن عرض التجانس النشوء والتطور ^4.

في حين أن هناك مجموعة واسعة بدلا من البحث عن البكتيريا الفصلاء، فقط تقرير عدد قليل من الدراسات على فاجات القادرة على إصابة أفراد هذا الجنس المتنوع. على الرغم من المثير للاهتمام، العمل المنجز سابقا على الفصلاء فاجات اللمسات على عدة مواضيع رئيسية متميزة مثل الكتابة التربة <م> الأنواع الفصلاء ^5، والاستخدامات الصناعية بهدف الحد من رغوة الضارة في محطات معالجة الحمأة المنشطة ^6، والعمل تسليط الضوء على إعادة التركيب محدد الموقع والجينات إنزيم مدمج ^7.

وقد استخدمت مختلف البروتوكولات تقنية تخصيب اليورانيوم لتوليد نقية فج يعزل في الأنواع الفصلاء. وتشمل الإجراءات المبكرة حضانات من التربة مع المواد السامة المضافة مثل الأملاح النيكوتين لفترات تزيد على سنة واحدة ⁸ مما أدى إلى فاجات القادرة على إصابة فقط A. globiformis. يسيل دراسات أجريت باستخدام التربة مع ظهرت العضوية عطوب لإنتاج فاجات اكتشافها عن طريق تقنيات فحص اللوحة، وحذف فترات حضانة طويلة ^8. على الرغم من المثير للاهتمام، تم استخدام تقنية تشبه الطلاء المباشر في الماضي مما أدى إلى عدة فاجات في حين لا تزال تواجه نسبة نجاح منخفضة وخاصة من قبل المحققين ^5، نقلا عن الدراسات السابقة مع معدلات النجاح منخفضة 8.

وعموما، كانت تقنيات عزل استخدمت في الماضي بارزة لديها فعالية كبيرة في الممارسة على الرغم من جنس الفصلاء تمثل التربة الهوائية الأكثر شيوعا عزل في الطبيعة ^4،9،، فان Twest وKropinski ¹⁰ طرق لتخصيب الحالية لعزل فاجات من المياه والتربة مقتبس من التقنيات السابقة المستخدمة في تخصيب العزلات البكتيرية البيئية ولكن تقنيات تخصيب هذه أثبتت عدم كفاءة في عزل فاجات الفصلاء. والغرض من هذا الأسلوب هو موضح هنا هو إظهار "دليل على مفهوم" أن أساليب التخصيب في وقت مبكر يمكن تكييفها لباستمرار وبشكل فعال عزل فاجات الفصلاء، والتغلب على التحديات التقنية السابقة المرتبطة عزل فاجات من هذا جنس البكتيريا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الخلايا Arthobacter لفج عزل

• ثقافة الفصلاء س. يشوبه KY3901 المستعمرات على لوريا Bertaini (LB) لوحة أجار المحتضنة في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. اختيار مستعمرة واستخدام حلقة عقيمة لإضافته إلى 250 مل من مرق LB في قارورة الثقافة حيرة واحتضان في حاضنة تهتز في 225 دورة في الدقيقة في 30 ° C.
• السماح حوالي 24 ساعة من النمو للحصول على خلايا مرحلة متأخرة الأسي / في وقت مبكر ثابتة للتجارب العدوى فج. رصد حالة نمو البكتيريا بشكل وثيق لمنع الخلايا من دخول الوسط إلى أواخر الدولة نمو ثابتة.
  يجب أن تتكون نمو الخلايا من OD الكثافة البصرية ₆₀₀ بين 0.5 .0.7 لإجراءات العزل فج وتنقية / الخطوات الموضحة أدناه: ملاحظة.

2. جمع فج من عينات التربة

1. جمع 200-400 غرام من التربة من الموقع المطلوب. ملاحظة: بما أن البكتيريا الموجودة في Arthrobaجنس cter هي بكتريا التربة المشتركة التي وفاجات التي تصيب منهم يمكن العثور عليها في وهم منتشر في معظم أنواع التربة.
2. إضافة 400 مل على الأقل من فج العازلة (PB) [68 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgSO _4، و 10 ملي تريس-CL (7.5 درجة الحموضة)] إلى التربة وخلط في قارورة كبيرة بما فيه الكفاية بحيث لا يقل عن 200 مل من PB هو في طاف وقادرة على استخراجها.
3. مزيج من قبل اثارة أو تحريكها بلطف حتى يتم وقف التنفيذ التربة والسماح للترسبات التربة ليستقر، وعادة 30 دقيقة.
4. تمرير "استخراج التربة" من خلال ورق الترشيح عن طريق الترشيح خطورة لإزالة التربة الحطام الرواسب.
5. إضافة مسحوق LB وخلط لتقديم حل 2٪ (4 ز LB مسحوق في 200 مل استخراج التربة).
6. تمرير الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون عن طريق الترشيح فراغ للحصول على الترشيح العقيمة. إذا كان ذلك ممكنا، انتقل إلى الخطوة 2.7 على الفور. إذا لزم الأمر، وتخزين تصفية العينات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل المتابعة، ومع ذلك، فإن عدد الجزيئات فج قابلة للحياةسيتم تخفيض.
7. قسامة متعددة 50 مل أجزاء من فلتر تعقيم LB / التربة استخراج الخليط الفردية 250 مل تعقيمها تهتز قوارير ثقافة حيرة باستخدام تقنيات العقيم. إضافة معقم 2.0 M CaCl ₂ حل للتركيزات النهائية المرجوة (0-50 ملم) منذ فاجات الفصلاء مختلفة تنمو على النحو الأمثل في إطار مختلف الظروف CaCl _2.
   ملاحظة: نحن نجد أن الغالبية العظمى من فاجات الفصلاء التي حددها لنا هي ضمن مجموعة من 1 ملم، 2.5 ملم CaCl _2. ومع ذلك، نمت العديد من فاجات معزولة من قبلنا حصريا في 0 ملي CaCl _2. أو في عالية جدا CaCl ₂ التركيزات. الشروع فورا إلى الخطوة 3.1.

3. فج عزل

1. إضافة 1-2،5 مل من أواخر الأسية / في وقت مبكر ثابتة ثقافة البكتيريا المرحلة إلى كل من قوارير. لOD ₆₀₀ 0،5-0،7، استخدم 1 مل من الخلايا. لOD ₆₀₀ أعلى من مجرد OD من 0.7 استخدام 2.5 مل منالخلايا.
   ملاحظة: خلايا في النمو الأسي المرحلة عادة ما تسفر عن المزيد من فاجات والتتر أعلى من الخلايا في النمو مرحلة ثابتة.
2. يهز قوارير في 250 دورة في الدقيقة في 30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 24 ساعة في حاضنة تهتز.
3. بعد فترة حضانة 24 ساعة إزالة قوارير التخصيب من الحاضنة تهتز وتمييع عينات تخصيب عشرة أضعاف في المخزن فج.
4. إنشاء أنابيب الثقافة مع 0.5 مل من أواخر الأسية / في وقت مبكر ثابتة ثقافة البكتيريا المرحلة وإضافة كميات متنوعة من الثقافة تخصيب (5 ميكرولتر إلى 500 ميكرولتر من 10 ^-1 التخفيف في PB) إلى أنابيب الثقافة.
   ملاحظة: ومن المستحسن لاختبار مجموعة واسعة من تركيزات لأن كل عينة التربة يولد التتر فج مختلفة بعد التخصيب.
5. إضافة CaCl ₂ إلى أنابيب الثقافة لجعل تركيز النهائي يساوي الحاضر التركيز في قارورة تخصيب الأصلية. استخدام مجموعة من تركيزات مختلفة CaCl ₂ لتحديد لكثير من فاجات ثإيث متفاوتة CaCl ₂ التبعيات.
   ملاحظة: سيتم عزل معظم فاجات ضمن نطاق CaCl ₂ من 1-2.5 ملي ولكن هناك فاجات معزولة أكثر على النحو الأمثل في أي مكان 0-50 ملي CaCl ₂ التركيزات. وبسبب هذا فمن الأفضل أن تحقق مجموعة من CaCl ₂ تركيزات إلى زيادة عدد فريدة فاجات الفصلاء معزولة.
6. خلط 4.5 مل من LB أعلى أجار في أنبوب الثقافة ويصب الخليط على لوحة أجار LB. دوامة بلطف لتوزيع عبر لوحة بالتساوي والسماح لأعلى أجار لترسيخ لحوالي 15 دقيقة.
   ملاحظة: أعلى أجار يمكن تحضير دفعات أكبر (250 مل) والاضافي أعلى أجار يمكن تخزينها في RT وإعادة استخدامها لتجارب لاحقة لمدة أسبوعين على الأقل. على الرغم من أن هناك صيغ مختلفة تستخدم في صنع كبار أجار، ونحن جعل أعلى أجار باستخدام 7G / L من أجار مختلطة مع LB. مكان أعلى أجار في 60 ° C حمام الماء للاحتفاظ الحالة السائلة أثناء التجربة.
7. عكس رانه لوحة واحتضان عند درجة الحرارة المطلوبة (درجة الحرارة إلى 30 ° C) O / N إلى 48 ساعة. وتختلف هذه الظروف لتحسين لفاجات الحالية. فاجات الأكثر عزلة تأتي من لوحات المحتضنة في 30 درجة مئوية في 1-2.5 ملي CaCl ₂ التركيز بعد فترة حضانة 24 ساعة.

4. فج تنقية

1. بعد 24 ساعة الاختيار الحضانة لتشكيل لوحة على لوحات. تستمر الحضانة لمدة تصل إلى 72 ساعة إذا لم ويحات واضحة أو لتحديد ما إذا كان سوف تظهر لويحات إضافية. إذا لزم الأمر، لوحات متجر مع لويحات المفترضة لمدة تصل إلى أسبوع في 4 درجات مئوية قبل المتابعة.
   ملاحظة: ليس من المألوف أن تجد مجموعة متنوعة من الأشكال التضاريسية لوحة مختلفة على لوحة واحدة. العثور على لويحات بعد 3 أيام من الحضانة هو ممكن ولكن نادرة.
2. تنقية فاجات المرجوة من لويحات معزولة بشكل واضح استخدام طريقة متتالية البلاك. لمس لوحة بعصا خشبية العقيمة. خط اللوحة عن طريق تشغيل عصا خشبية من خلال لهب، allowinز العصا لتبريد لفترة وجيزة، ثم فرك العصا على لوحة أجار في اقتراح لطيف كما هو مبين في الشكل رقم 1. كرر ذلك باستخدام عصا نظيفة لكل بالمرور.
3. بدلا من ذلك، استخدم التقليدي الفحص عيار البلاك لعزل ويحات فج الفردية. الفحص عيار وحة لا تتطلب استخدام المزيد من الكواشف مثل LB أجار وLB أعلى أجار والمواد مثل لوحات بتري لعزل فج البلاك. لقد كنا ناجحة للغاية باستخدام طريقة خط وحة لكنه أسهل من الناحية الفنية لعزل ويحات الفردية باستخدام الفحص عيار البلاك.
4. بمجرد مجزع لوحة أجار LB ثلاث مرات على الأقل، بمناسبة منطقة بأقل تركيز الجزيئات فج المفترضة وتطبيق بلطف 0.5 مل من الفصلاء و 4.5 مل من المنصهر LB أعلى أجار (التي تحتوي على نفس التركيز من كلوريد الكالسيوم مثل لوحة الأم ) وتسمح له بالانتشار بالتساوي على طبق من ذهب.
5. عكس واحتضان لوحة O / N. كرر وحة متتاليةمعزول تقنية لا يقل عن ثلاث مرات التكرار لضمان وجود الأنواع فج نقية. متجر لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع حسب الحاجة بين الشرائط دون خسائر كبيرة في جدوى فج.
6. وقد نمت لويحات مرة واحدة المطلوب وعزل على لوحة خط النهائية، لمسة واحدة لوحة معزولة جيدا مع طرف ممص مكروى واعادة تعليق في 100 ميكرولتر PB. تمييع متسلسل هذا 10 ⁰ الحل إلى التخفيف 10 ^-8 عن طريق تمرير 20 ميكرولتر من العينة إلى 180 ميكرولتر من PB الطازجة.
7. إضافة 10 ميكرولتر من كل تخفيف إلى 0.5 مل من يزرع الفصلاء في أنبوب الثقافة لمدة 5 إلى 10 دقيقة في RT ولوحة عن طريق خلط البكتيريا المصابة مع 4.5 مل من المنصهر LB أعلى أجار التي تحتوي على نفس التركيز من CaCl ₂ تستخدم لعزل فج من عينة التربة الأصلية. حفظ جميع التخفيفات التي قدمت في 4 ° C حتى اليوم التالي.
8. تحديد التخفيف المتسلسل فج اللازمة لجعل نمط الويب باستخدام عيار وحة التقليدي كماأقول. الغرض من فحص عيار البلاك هو تحديد عيار فج اللازمة للحصول على لوحة نمط الويب. تحديد نمط لوحة الويب كما تخلو في معظمها من البكتيريا ولكن تحتوي على بقايا من البكتيريا التي لم يتم حتى الآن هي lysed من قبل فاجات. إضافة 5 مل من أواخر الأسية / في وقت مبكر الثقافة الفصلاء ثابتة إلى معقمة 50 مل قارورة الثقافة.
   1. إضافة 100 ميكرولتر من التخفيف (التي أعطت نموذجا على شبكة الإنترنت لثقافة الفصلاء) في قارورة الثقافة والسماح للفاجات لتصيب خلايا البكتيريا لمدة 5 إلى 10 دقيقة في RT. خلط مع المنصهر LB أعلى أجار التي تحتوي على نفس التركيز من CaCl ₂ كما تستخدم لتحديد البداية وفج لوحة 5 مل من هذا الخليط على 10 لوحات LB جديدة. السماح لترسيخ واحتضان لوحات مقلوبة في 30 ° C.
9. في اليوم التالي، إغراق لوحات نمط الويب مع 5 مل من PB وتخزين O / N عند 4 درجات مئوية أو 4 ساعة على RT.
10. تصفية المحللة فج من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرونوتخزينها في 4 درجات مئوية. استخدام هذا المخزون فج النهائي للتجارب إضافية مثل الصور المجهر الإلكتروني من جسيمات فج، فج عزل الحمض النووي الجينومية لتحليل انزيم التقييد DNA وتسلسل الجيني باستخدام إجراءات القياسية. للتخزين على المدى الطويل من الأسهم فج، إضافة كمية متساوية من المحللة فج لالجلسرين معقم في قوارير صغيرة لحفظ الأوراق المالية في -80 ° C.
    ملاحظة: بالنسبة لأولئك لم تشهد مع هذه التقنيات فج، مورد العظيم هو موقع على الانترنت www.phagesdb.org الوصول إليها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لإثبات استنساخ لتحسين تقنية تخصيب للفاجات الفصلاء، استخدمت 30 عينات من التربة مختلفة في أوقات مختلفة وأماكن خلال فصلي الربيع والصيف من عام 2014. ومن بين هذه العينات 30 التربة تم الحصول فاجات الفصلاء فريدة من 22 من عينات التربة التي تم جمعها باستخدام هذا التخصيب ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وعلى الرغم من العديد من المحاولات السابقة لعزل فاجات القادرة على إصابة المضيفين الفصلاء، كان لدينا نجاح يذكر باستخدام إجراءات تخصيب القياسية. طريقة المعمم تخصيب البكتيرية المتقدمة وتكييفها من قبل فان Twest وKropinski ¹⁰ إلى إثراء فاجات من العينات البيئية يبقى ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
0.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 ml pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 ml conical tubes	Fisher	76002844
15 ml conical tubes	Fisher	76002845
10 ml pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 ml pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824