Uma técnica de enriquecimento Aperfeiçoado para o isolamento de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriophage Espécie de amostra de solo Isolados

Resumo

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Resumo

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Introdução

A onipresença de espécies Arthrobacter em ambientes de solo oferece um vasto número e diversidade de fagos capazes de serem isolados nessa espécie de bactérias hospedeiras. Bacterianas membros da família Acintobacteriaceae são o mais notável para suas vias catabólicas de degradar compostos recalcitrantes como atrazina e vários outros pesticidas e herbicidas ^1,2,3. Embora a maioria das pesquisas tem sido feito utilizando estirpes ambientais de Arthrobacter, isolados clínicos deste gênero é encontrado no sangue, urina, olhos, e muitas outras fontes humanas todos exibindo heterogeneidade filogenética ^4.

Enquanto não há um corpo bastante extensa pesquisa sobre bactérias Arthrobacter, apenas alguns estudos relatam sobre os fagos capazes de infectar membros deste gênero diverso. Curiosamente, porém, o trabalho feito anteriormente em Arthrobacter fagos toques sobre diversos temas distintos-chave, tais como a digitação de solo espécies Arthrobacter ^5, usos industriais, com o objetivo de reduzir espuma deletéria em estações de tratamento de lamas activadas ^6, e destacando o trabalho de recombinação sítio específico e genes integrase ^7.

Vários protocolos técnica de enriquecimento têm sido empregadas para gerar pura fago isolados em espécies Arthrobacter. Procedimentos iniciais incluem incubações de solo com agentes tóxicos adicionais como sais de nicotina por períodos de mais de um ano ⁸ dando origem a fagos capazes de infectar apenas A. globiformis. Estudos feitos usando solo percolados com orgânicos instáveis ​​apareceu para produzir fagos detectáveis ​​através de técnicas de ensaio de placa, omitindo períodos de incubação longos ^8. Curiosamente, porém, uma técnica parecida com semeadura direta foi utilizado no passado dando origem a vários fagos enquanto continua a ter uma baixa taxa de sucesso nomeadamente pelos investigadores ^5, citando estudos anteriores com baixas taxas de sucesso 8.

No geral, as técnicas de isolamento usados ​​no passado eram notável por ter pouca eficácia na prática, apesar das género Arthrobacter representativas do solo aeróbico mais comum isolar na natureza ^4,9,, Van Twest e Kropinski ¹⁰ atuais métodos de enriquecimento para isolamento de fagos a partir da água e do solo adaptado a partir de técnicas anteriores utilizadas para enriquecer isolados bacterianos ambientais, mas estas técnicas de enriquecimento se mostrou ineficiente para isolar fagos Arthrobacter. O objectivo do método descrito aqui é mostrar "prova de conceito" que os métodos de enriquecimento precoces podem ser adaptados de forma consistente e eficaz isolar fagos Arthrobacter, ultrapassar os desafios técnicos anteriores, associados com o isolamento de fagos a partir deste género bacteriano.

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Protocolo

1. Preparação de células Arthobacter para Fago Isolation

• Cultura de Arthrobacter sp. KY3901 colónias riscadas em um Bertaini Luria (LB) agar placa incubada a 30 ° C durante 2-3 dias. Escolha uma colónia e usar uma ansa estéril para adicioná-lo a 250 ml de caldo LB num frasco de cultura com chicanas e incubar numa incubadora com agitação a 225 rpm a 30 ° C.
• Reserve em torno de 24 horas de crescimento para obter células estacionárias exponenciais / início de final de fase para experimentos de infecção fago. Monitorar o estado de crescimento bacteriano de perto para evitar que as células de entrar no meio para o final estado estacionário de crescimento.
  NOTA: O crescimento celular deve consistir de uma densidade óptica OD ₆₀₀ entre 0,5-.0.7 para os procedimentos de isolamento e purificação de fago / passos descritos abaixo.

2. Recolha de Fago de amostras de solo

1. Reúna 200-400 g de solo do local desejado. Nota: Uma vez que as bactérias no ArthrobaCTER género são bactérias comuns do solo e que os fagos que eles infectam pode ser encontrado em e são difundidas na maior parte dos tipos de solo.
2. Adicionar, pelo menos, 400 ml de tampão de fagos (PB) [NaCl 68 mM, 10 mM de MgSO _4, 10 mM de Tris-Cl (pH 7,5)] para o solo e misturar num frasco grande o suficiente para que, pelo menos, 200 ml de PB é no sobrenadante e é capaz de ser extraído.
3. Misture por agitação ou rodando suavemente até que o solo está suspenso e permitir que os sedimentos do solo para resolver, tipicamente 30 min.
4. Passe o "extrato de solo" por papel de filtro por filtração por gravidade para remover os restos de sedimentos do solo.
5. Adicionar LB pó e misturar para fazer uma solução a 2% (4 g LB pó em 200 ml de extracto de solo).
6. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um por filtração em vácuo para se obter um filtrado estéril. Se possível, continue no passo 2.7 imediatamente. Caso seja necessário, armazenar as amostras filtradas a 4 ° C durante até uma semana antes de continuar, no entanto, o número de partículas fágicas viáveisserá reduzido.
7. Múltipla alíquota de 50 ml da mistura de extrato de LB / solo esterilizado por filtração em individuais de 250 ml esterilizadas tremendo frascos de cultura perplexos usando técnicas assépticas. Adicionar estéril M de _CaCl2 solução 2,0 para as concentrações finais pretendidas (0-50 mM) uma vez que diferentes fagos de Arthrobacter crescem optimamente sob diferentes condições de CaCl _2.
   NOTA: Descobrimos que a maioria dos fagos Arthrobacter identificados por nós estão dentro da gama de 1 mM-2,5 mM de _CaCl2. No entanto, vários dos fagos isolados cresceram nos exclusivamente a 0 _mM CaCl2 .ou a concentrações muito elevadas de CaCl _2. Prossiga imediatamente para a etapa 3.1.

3. Fago Isolation

1. Adicionar 1 a 2,5 ml de exponencial tardia / estacionária antecipada bactérias em fase de cultura para cada um dos frascos. Para uma _DO600 0,5-0,7, utilizar 1 ml de células. Para uma _DO600 superior a uma DO de 0,7 2,5 ml de usarcélulas.
   NOTA: As células em fase de crescimento exponencial normalmente produzem mais fagos e títulos mais elevados do que as células em crescimento fase estacionária.
2. Frascos de agitação a 250 rpm a 30 ° C durante aproximadamente 24 horas numa incubadora com agitação.
3. Após um período de incubação de 24 h remover frascos de enriquecimento da incubadora com agitação e diluir as amostras de enriquecimento de dez vezes em tampão de fago.
4. Configure tubos de cultura com 0,5 ml de tarde exponencial / início de bactérias em fase estacionária cultura e adicionar várias quantidades de a cultura de enriquecimento (5 mL a 500 mL de uma diluição 10 ^-1 em PB) para os tubos de cultura.
   NOTA: É aconselhável testar uma ampla gama de concentrações uma vez que cada amostra de solo gera diferentes títulos de fagos após enriquecimento.
5. Adicionar _CaCl2 para tubos de cultura para obter uma concentração final igual à concentração presente no frasco de enriquecimento inicial. Use uma variedade de diferentes concentrações de CaCl ₂ para selecionar para muitos fagos wom variando CaCl ₂ dependências.
   NOTA: A maioria dos fagos será isolado dentro do _CaCl2 gama de 1-2,5 mM mas há fagos isolados mais de forma ideal em qualquer lugar 0-50 mM _de CaCl2 concentrações. Por isso, o melhor é verificar uma série de CaCl ₂ concentrações de maximizar o número de Arthrobacter fagos únicas isoladas.
6. Misturar 4,5 ml de LB agar superior no tubo de cultura e despeje a mistura em uma placa de ágar LB. Agitar suavemente o frasco para distribuir uniformemente ao longo da placa e para permitir agar de topo solidificar durante aproximadamente 15 minutos.
   NOTA: Topo de agar podem ser preparadas em lotes maiores (250 ml) e agar de topo extra pode ser armazenado à temperatura ambiente e reutilizado para as experiências subsequentes, durante pelo menos duas semanas. Embora existam diferentes fórmulas utilizadas para fazer agar top, fazemos top agar usando 7g / L de agar misturado com LB. Ponto de agar de topo num banho de água a 60 ° C para manter o estado líquido durante o decurso de uma experiência.
7. Inverter tele placa e incubar a temperatura desejada (temperatura de 30 ° C) O / N a 48 h. Alterar estas condições para otimizar os fagos presentes. Mais fagos isolados provenientes de placas incubadas a 30 ° C a 1-2,5 mM de CaCl ₂ a concentração após um período de incubação de 24 horas.

4. Fago Purificação

1. Após uma incubação de 24 horas de verificação para a formação de placas em placas. Continue incubação por até 72 horas, se não há placas são evidentes ou para determinar se as placas adicionais aparecerão. Se necessário, as placas de loja com placas putativas de até uma semana a 4 ° C antes de prosseguir.
   NOTA: Não é raro encontrar uma variedade de diferentes morfologias de placa em um prato. Encontrar placas após 3 dias de incubação, é possível, mas raro.
2. Purificar fagos desejados de placas claramente isolado utilizando o método raia placa. Toque em uma placa com uma vara de madeira estéril. Streak a placa executando uma vara de madeira através de uma chama, allowing o pau para esfriar brevemente, e, em seguida, esfregando o pau na placa de agar no movimento suave, como mostrado na Figura 1. Repita esta usando uma vara limpa para cada passagem.
3. Em alternativa, usar o ensaio de título de placa tradicional para isolar placas de fagos individuais. O ensaio de titulação da placa requer a utilização de mais reagentes, tais como agar LB e agar de topo LB e materiais, tais como placas de petri para o isolamento do fago de placa. Temos sido muito bem sucedida usando o método raia placa, mas é tecnicamente mais fácil isolar placas individuais utilizando o ensaio título placa.
4. Uma vez que a placa de agar LB é riscada pelo menos três vezes, marcar a área com a menor concentração de partículas fágicas putativas e suavemente aplicar 0,5 ml de Arthrobacter e 4,5 ml de agar de topo LB fundida (contendo a mesma concentração de cloreto de cálcio, tal como a placa-mãe ) e deixe-a espalhar uniformemente ao longo da placa.
5. Inverter e incubar placa O / N. Repita a placa raiatécnica para, pelo menos, três iterações para garantir uma espécie de fagos puros é isolado. Armazenar as placas a 4 ° C durante até uma semana, conforme necessário entre estrias, sem perda significativa da viabilidade do fago.
6. Uma vez que as placas desejadas tenham sido cultivadas e isolado na placa raia final, toque em uma placa bem isolado com uma ponta de micropipeta e suspender novamente em 100 PB ul. Serialmente dilua esta solução a 10 ⁰ para a diluição de 10 ^-8, passando 20 ul da amostra em 180 ul de PB fresco.
7. Adicionam-se 10 ul de cada diluição de 0,5 ml de Arthrobacter crescido num tubo de cultura para 5 a 10 minutos à temperatura ambiente e placa misturando as bactérias infectadas com 4,5 ml de agar de topo LB fundida contendo a mesma concentração de _CaCl2 utilizada para isolar o fago a partir da amostra original do solo. Salve todas as diluições feitas a 4 ° C até o dia seguinte.
8. Determinar a diluição em série fago necessária para fazer um teste padrão da web usando o título de placa tradicional comodizer. O objectivo do ensaio de titulação de placa é determinar o título de fago necessária para obter uma placa padrão de teia. Identificar uma placa padrão de teia como na maior parte isenta de bactérias, mas que contém vestígios de bactérias que ainda não tenham sido submetidas a lise por fagos. Adicionar 5 ml de tarde exponencial / início de cultura Arthrobacter estacionário a um frasco estéril cultura de 50 ml.
   1. Adicionar 100 ul da diluição (que deu um padrão de teia para a cultura de Arthrobacter) no frasco de cultura e permitir que os fagos para infectar as células de bactérias por 5 a 10 min a RT. Misturar com fundido de topo LB agar contendo a mesma concentração de CaCl ₂ como inicialmente utilizados para identificar o fago e placa 5 ml desta mistura sobre 10 placas de LB fresco. Deixa-se solidificar e incubar as placas invertidas a 30 ° C.
9. No dia seguinte, inundar as placas em forma de rede com 5 ml de PB e armazenamento de O / N a 4 ° C ou 4 horas à temperatura ambiente.
10. Filtra-se o lisado de fago através de um filtro de seringa de 0,22? Me armazenar a 4 ° C. Use este inventário final fago para experiências adicionais, tais como imagens de microscopia electrónica de partículas de fago, o fago de isolamento de ADN genómico para análise de enzimas de restrição e sequenciação de DNA genómico usando procedimentos padrão. Para armazenamento a longo prazo do stock de fagos, adicionar uma quantidade igual de lisato de fago de glicerol estéril em frascos pequenos para arquivamento estoque a -80 ° C.
    NOTA: Para aqueles que não experimentaram com estas técnicas de fagos, um grande recurso é o site www.phagesdb.org acessível online.

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Resultados

Para demonstrar reprodutibilidade da melhoria técnica de enriquecimento de fagos Arthrobacter, 30 amostras de solo diferentes foram usados ​​em diferentes momentos e locais durante a primavera eo verão de 2014. Destes 30 amostras de solo fagos Arthrobacter originais foram obtidos a partir de 22 de amostras de solo coletadas usando este enriquecimento procedimento. O processo de enriquecimento de fagos padrão originou únicas de 3 das mesmas amostras de solo. As amostras de enriquecimento podem t...

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Discussão

Apesar de muitas tentativas anteriores para isolar fagos capazes de infectar hospedeiros Arthrobacter, tivemos pouco sucesso utilizando procedimentos de enriquecimento padrão. O método de enriquecimento bacteriana generalizada desenvolvido e adaptado por van Twest e Kropinski ¹⁰ para enriquecer os fagos a partir de amostras ambientais continuam a base para a maioria dos procedimentos de enriquecimento. Evidências de estudos anteriores sugerem que métodos de plaqueamento direto produziram placas d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
0.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 ml pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 ml conical tubes	Fisher	76002844
15 ml conical tubes	Fisher	76002845
10 ml pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 ml pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824