Оптимизированная Техника по обогащению для изоляции<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Бактериофаг Виды из образца почвы изолирует

Резюме

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Аннотация

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Введение

Широкое распространение Arthrobacter видов почвенных условиях предлагает огромное количество и разнообразие фагов, способных быть изолированы от этого вида бактерий-хозяев. Бактериальные члены семьи Acintobacteriaceae являются наиболее заметным за их катаболических путей деградации непокорных соединений, таких как атразина и других различных пестицидов и гербицидов ^1,2,3. Хотя большинство исследований было сделано с помощью экологических штаммов Arthrobacter, клинические изоляты этого рода находится в крови, моче, глаз и многих других человеческих источников все отображения филогенетическое неоднородность ^4.

В то время как есть, а многочисленные исследования по Arthrobacter бактерий, всего в нескольких исследованиях сообщается на фагов, способных инфицировать членов этой разнообразной рода. Интересно, хотя, работа ранее на Arthrobacter фагов штрихи на нескольких ключевых отдельные темы, такие, как печатать почвы Arthrobacter видов ^5, промышленного применения с целью уменьшения вредного пены в активированных обработки осадка растений ^6, и работа выделив сайт-специфическое рекомбинации и интегразы гены ^7.

Различные протоколы обогащения техника были использованы для создания чистого фага изолирует в Arthrobacter видов. Ранние процедуры включают инкубацию почвы с добавленными токсичных веществ, таких как никотин солей для периодов, превышающих один год ^8, послуживших основанием для фагов, способных только заражает А. globiformis. Исследования, проведенные с помощью почву просачивается с лабильные органические появился для производства обнаруживаемыми фагов с помощью зубного налета методов анализа, опуская длинные периоды инкубации ^8. Интересно, хотя, техника, напоминающие прямой металлизации был использован в прошлом, давая начало нескольким фагов в то время как все еще ​​имея в частности, низкий уровень успеха в деятельности следователей ^5, ссылаясь на прошлые исследования с низким уровнем успеха ^8.

В целом, методы изоляции, используемые в прошлом отличались за то, что мало эффективность в практике, несмотря на Arthrobacter рода, представляющих наиболее распространенные аэробные почву изолировать в природе ^4,9, Ван Twest и Кропински ¹⁰ современные методы обогащения для выделения фагов из воды и почвы адаптировано из ранних методов, используемых для обогащения экологических бактериальных изолятов, но эти методы обогащения оказалась неэффективной в изоляции Arthrobacter фагов. Целью способа, описанного здесь, чтобы показать "доказательство концепции", что ранние способы обогащения может быть приспособлен, чтобы последовательно и эффективно изолировать фаги Arthrobacter, преодолевая прежние технические проблемы, связанные с выделением фагов из этой бактериальной рода.

протокол

1. Подготовка Arthobacter Клетки для фага изоляции

• Культура Arthrobacter Sp. KY3901 колонии штрихом на Лурии Bertaini (LB) агаром инкубировали при 30 ° С в течение 2-3 дней. Выберите колонию и использовать стерильную петлю, чтобы добавить его к 250 мл LB бульоне в экранированной культуры колбу и инкубировать в дрожащей инкубаторе при 225 оборотах в минуту при температуре 30 ° C.
• Разрешить примерно 24 ч роста, чтобы получить поздно показательные / начале стационарной фазы клетки для фаговой инфекции экспериментов. Мониторинг состояния бактериального роста тесно, чтобы предотвратить клетки от ввода в середине и конце стационарного состояния роста.
  ПРИМЕЧАНИЕ: рост клеток должен состоять из оптической плотности OD ₆₀₀ от 0,5-.0.7 для изоляции процедур фага и очистки / шагов, описанных ниже.

2. Сбор фага из почвы Образцы

1. Соберите 200-400 г почвы от нужное место. Примечание: Поскольку бактерии, в Arthrobacter род являются общими почвенных бактерий они и фаги, которые заражают их можно найти в и широко распространены в большинстве типов почв.
2. Добавить по крайней мере, 400 мл фага буфера (PB) [68 мм NaCl, 10 мМ MgSO _4, 10 мМ Трис-CL (рН 7,5)] в почву и смешать в достаточно большом колбу так, чтобы по крайней мере 200 мл PB является в надосадочной жидкости и может быть извлечена.
3. Смешать аккуратно помешивая или вращая до тех пор, почва не приостанавливается и позволяют осадка почвы для урегулирования, как правило, 30 мин.
4. Пропустите "экстракт почвы" через фильтровальную бумагу под действием силы тяжести фильтрации для удаления почвы осадка мусора.
5. Добавить LB порошок и смешать, чтобы сделать 2% раствор (4 г LB порошок в 200 экстрактом мл почвы).
6. Пропускают раствор через 0,22 мкм фильтр с помощью вакуумной фильтрации, чтобы получить стерильный фильтрат. Если это возможно, по-прежнему, чтобы сразу же выйти 2,7. В случае необходимости, магазин фильтруют образцы при температуре 4 ° С в течение одной недели, прежде чем продолжить, однако, количество жизнеспособных фаговых частицбудет сокращено.
7. Алиготе несколько порциями по 50 мл с фильтром стерилизовать LB / почвы экстракта смеси на отдельные 250 мл стерилизованные пожимая недоумение культуры колбы с использованием асептических методов. Добавить стерильной 2,0 M CaCl решение ₂ от конечного значения требуемой концентрации (0-50 мм), так как различные фаги Arthrobacter расти оптимально при различных CaCl ₂ условиях.
   Примечание: Мы обнаружили, что большинство из Arthrobacter фагов, определенных нами находятся в диапазоне от 1 мМ-2,5 мМ CaCl _2. Тем не менее, некоторые из изолированных фагов вырос на нас исключительно на 0 мМ CaCl ₂ .or при очень высоких концентрациях CaCl _2. Немедленно приступить к шагу 3.1.

3. фага Изоляция

1. Добавить 1 до 2,5 мл конце экспоненциальной / начале стационарной фазы бактерии культуры в каждую из колб. Для OD ₆₀₀ от 0,5-0,7, используйте 1 мл клеток. Для OD ₆₀₀ выше, чем наружный диаметр 0,7 использовать 2,5 млклетки.
   Примечание: Клетки в логарифмической фазе роста, как правило, дают более фагов и более высокие титры, чем клеток в стационарной фазы роста.
2. Колбах на 250 оборотов в минуту при 30 ° С в течение приблизительно 24 ч в инкубаторе со встряхиванием.
3. После инкубационного периода 24 ч удалить обогащению колбы с трясущейся инкубатора и разбавления проб обогащения в десять раз в фага буфера.
4. Установка культуры трубки с 0,5 мл конце экспоненциальной / начале стационарной фазы бактериальной культурой и добавить различные количества культуры обогащения (5 мкл до 500 мкл разведения в 10 ^-1 в Pb) к культуре труб.
   Примечание: Желательно, чтобы проверить широкий диапазон концентраций, так как каждый образец почвы создает различные титры фагов после обогащения.
5. Добавить CaCl ₂ в пробирках с культурой, чтобы конечная концентрация равна концентрации в исходном колбу обогащения. Использование диапазона различных концентрациях CaCl _2, чтобы выбрать для многих фагов шIth различной CaCl ₂ зависимостей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство фаги будут изолированы в пределах CaCl ₂ диапазона 1-2,5 мм, но есть фаги, выделенные наиболее оптимально в пределах от 0-50 мМ концентраци CaCl _2. Из-за этого лучше всего проверить ряд CaCl ₂ концентрацией, чтобы максимизировать количество уникальных изолированных Arthrobacter фагов.
6. Смешайте 4,5 мл LB верхнего агара в пробирку и налейте смесь на чашки с агаром LB. Вихревой аккуратно, чтобы распределить по всей пластине равномерно и позволяют верхнего агара для отверждения в течение примерно 15 мин.
   Примечание: Лучшие агар, могут быть получены в больших партий (250 мл) и дополнительной агар верхней можно хранить при комнатной температуре и использовать повторно для последующих экспериментов по меньшей мере, две недели. Хотя существуют различные формулы, используемые, чтобы сделать верхнюю агар, мы делаем верхнего агара с помощью 7g / л агара, смешанного с ЛБ Место верхнего агара в водяной бане при 60 °, чтобы сохранить жидкое состояние в ходе эксперимента.
7. Обратить тОн пластины и инкубировать при желаемой температуре (температура 30 ° С) O / N до 48 ч. Вары эти условия для оптимизации фагов, присутствующих. Большинство изолированных фагов приходят от планшеты инкубировали при 30 ° С в 1-2,5 мМ CaCl ₂ концентрацией после инкубационного периода 24 ч.

4. фага Очистка

1. После проверки инкубации 24 ч для образования бляшек на пластинах. Продолжить инкубации в течение 72 ч, если нет таблички не очевидны или, чтобы определить, на экране появятся дополнительные таблички. При необходимости, хранить пластины с Предполагаемые бляшки на срок до недели при 4 ° С до судебного разбирательства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это не редкость, чтобы найти множество различной морфологии бляшек на одной пластине. Обнаружение бляшки после 3 дней инкубации можно, но редко.
2. Очищают нужные фагов из четко выделенных бляшек с использованием метода подряд налета. Нажмите мемориальную доску со стерильным деревянной палкой. Серия доска, запустив деревянную палочку через пламя, allowinг палку кратко остыть, а затем потирая палку на агар пластины в нежные движения, как показано на рисунке 1. Повторите это с помощью чистой палку для каждого прохода.
3. Кроме того, использование традиционных доска титр анализа для выделения отдельных бляшек фага. Доска титр анализа требует использования более реагентами, такими как LB-агар и агар LB верхней и материалов, таких как чашки Петри для изоляции фага бл шек. Мы были весьма успешными с помощью метода подряд налета, но это технически легче изолировать отдельные бляшки с помощью доска титр анализа.
4. После того, как агар пластины LB Полосы по меньшей мере, три раза, выделить участок с самой низкой концентрации предполагаемых фаговых частиц и осторожно применять 0,5 мл Arthrobacter и 4,5 мл расплавленной верхней LB-агар (содержащий ту же концентрацию хлорида кальция в качестве родительского пластины ) и дайте ему равномерно по всей пластине.
5. Обратить и инкубировать пластины O / N. Повторите Убийств подряд налетТехника по крайней мере, трех итераций, чтобы обеспечить чистые виды фагов выделяют. Храните пластины при 4 ° С в течение одной недели при необходимости между полосами без существенной потери фага жизнеспособности.
6. После получения желаемого бляшки были выращены и изолированные на заключительном разводов пластины, нажмите один хорошо изолированы доску с наконечником микропипетки и вновь приостановить в 100 мкл PB. Серийно разбавить этот раствор 10 ⁰ к разбавлению 10 ^-8 пропусканием 20 мкл образца в 180 мкл свежей PB.
7. Добавить 10 мкл каждого разбавления в 0,5 мл выращенной Arthrobacter в пробирку 5 до 10 мин при комнатной температуре и пластины путем смешивания инфицированных бактерий с 4,5 мл расплавленной верхней LB-агар, содержащий ту же концентрацию CaCl _2, используемый для изоляции фага от первоначального образца почвы. Сохраните все разведения Сделано в 4 ° C до следующего дня.
8. Определить фага серийное разведение необходимое, чтобы сделать веб-шаблон с использованием традиционного зубного налета титр каксказать. Цель доска титра анализа является определение титра фага, необходимых для получения веб-шаблон пластины. Определить узор веб пластины в основном лишенный бактерий, но содержащий остатки бактерий, которые еще не были лизированы фагов. Добавить 5 мл конце экспоненциальной / начале стационарной Arthrobacter культуры в стерильную 50 мл культуральной колбы.
   1. Добавить 100 мкл разведения (что дало веб-шаблон к Arthrobacter культуры) в культуральной колбы и позволяют фаги заразить клетки бактерий от 5 до 10 мин при комнатной температуре. Смешайте с расплавленным LB верхнего агара, содержащего такую ​​же концентрацию CaCl _2, используемый, чтобы первоначально определить фага и пластины 5 мл этой смеси на 10 свежих LB пластинах. Дать застыть и инкубировать перевернутые тарелки при 30 ° C.
9. На следующий день, наводнение веб-шаблонов пластины с 5 мл ПБ и хранения O / N при 4 ° С или 4 ч при комнатной температуре.
10. Фильтр фага лизата через шприцевой фильтр 0,22 мкми хранить при 4 ° С. Используйте этот заключительный фага для дополнительных экспериментов, таких как электронная микроскопия изображений фаговых частиц, фага геномной выделения ДНК для анализа ограничение ДНК фермента и геномной последовательности с использованием стандартных процедур. Для длительного хранения фаговой наличии, добавляют равное количество лизата фага с стерильным глицерином в небольших пробирках для фондовой архивирования при -80 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для тех, кто не испытал с этими методами фагов, большой ресурс доступны в режиме онлайн сайт www.phagesdb.org.

Результаты

Чтобы продемонстрировать воспроизводимость улучшенную методику обогащения для Arthrobacter фагов, 30 различных образцов почвы были в разное время и местах в течение весны и лета 2014 года из этих образцов 30 почвенных уникальные Arthrobacter фаги, полученных из 22 собранных проб почвы с помо...

Обсуждение

Несмотря на многие предыдущие попытки изолировать фаги, способные заражать Arthrobacter хозяев, мы не имел большого успеха, используя стандартные процедуры по обогащению. Обобщенный метод бактериального обогащения разработаны и адаптированы ван Twest и Кропински ¹⁰ обогатить фагов...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 mL pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 mL conical tubes	Fisher	76002844
15 mL conical tubes	Fisher	76002845
10 mL pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 mL pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824