Eine optimierte Enrichment-Technik für die Isolierung von<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bakteriophagen Arten von Bodenprobe Isolate

Zusammenfassung

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Zusammenfassung

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Einleitung

Die Allgegenwärtigkeit von Arthrobacter species in Boden-Umgebungen bietet eine große Anzahl und Vielfalt der Phagen Lage ist, von dieser Art von Wirtsbakterien isoliert. Bakterielle Mitglieder der Familie Acintobacteriaceae Weise bestehen für ihre Abbauwege abbau widerspenstigen Verbindungen wie Atrazin und verschiedenen anderen Pestiziden und Herbiziden ^1,2,3. Obwohl die meisten der Forschung wurde mit Umweltbelastungen von Arthrobacter getan wird klinische Isolate dieser Gattung in Blut, Urin, Augen, und viele andere menschliche Quellen alle Anzeigen von phylogenetischen Heterogenität ⁴ gefunden.

Zwar gibt es eine recht umfangreiche Anzahl von Studien auf Arthrobacter Bakterien, nur wenige Studien berichten über die Phagen infizieren kann Mitglieder dieser vielfältigen Gattung. Interessant ist jedoch, zuvor an Arthrobacter getan Phagen berührt mehrere wichtige unterschiedliche Themen wie die Eingabe der Boden Arthrobacter species ^5, industrielle Zwecke mit dem Zweck der Reduzierung schädlicher Schaum in Belebtschlammanlagen ⁶ und Arbeit hervorgehoben ortsspezifische Rekombination und Integrase-Gene ^7.

Verschiedene Anreicherungsverfahrens Protokolle wurden verwendet, um zu erzeugen reine Phagen-Isolate in Arthrobacter species. Frühe Verfahren umfassen Inkubation des Bodens mit aufgenommen Giftstoffe wie Nikotin Salze für die Dauer von mehr als einem Jahr ^8, die zu Phagen in der Lage, nur infizieren A. globiformis. Studien mit Erde getan versickert mit labilen organischen schien nachweisbar Phagen durch Plaque-Assay-Techniken erzeugen, jedoch ohne lange Inkubationszeiten ^8. Interessanterweise wurde eine Technik ähnlich direkte Beschichtung in der Vergangenheit, die zu mehreren Phagen, während immer noch eine deutlich geringe Erfolgsquote von den Ermittlern ⁵ verwendet, unter Berufung auf frühere Studien mit niedrigen Erfolgsraten 8.

Insgesamt waren die Isolationstechniken in der Vergangenheit bekannt für eine geringe Wirksamkeit in der Praxis trotz der Gattung Arthrobacter, die die häufigsten aeroben Boden in der Natur ^{4,9 isolieren,} Van Twest und Kropinski ¹⁰ vorhanden Anreicherungsverfahren zur Isolierung von Phagen aus Wasser und Boden von früheren Techniken zum Umwelt Bakterienisolate aber diese Anreicherungstechniken bereichern angepasst erwiesen ineffizient bei der Isolierung Arthrobacter Phagen. Der Zweck des hier beschriebenen Verfahrens ist es, "proof of concept" zeigen, dass die frühen Anreicherungsverfahren angepasst werden, um konsequent und effektiv isolieren Arthrobacter Phagen, die Überwindung vorherige technische Herausforderungen mit Trenn Phagen aus dieser Bakteriengattung zugeordnet werden.

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen für Arthobacter Phage Isolation

• Kultur Arthrobacter sp. KY3901 Kolonien ausgestrichen auf Luria Bertaini (LB) Agarplatten bei 30 ° C für 2-3 Tage inkubiert. Wählen Sie eine Kolonie und eine sterile Schleife, um es zu 250 ml LB-Medium in einem Schikanekulturflasche in einem Schüttelinkubator bei 225 Umdrehungen pro Minute bei 30 ° C hinzu und inkubieren.
• Lassen Sie etwa 24 Stunden des Wachstums zur späten exponentiellen / frühen stationären Phase Zellen für Phageninfektionsversuche zu erhalten. Überwachen Sie den Zustand der Bakterienwachstum eng mit Zellen aus Eingabe der mittleren bis späten stationären Wachstumszustand zu verhindern.
  ANMERKUNG: Das Zellwachstum sollte eines optischen Dichte OD ₆₀₀ zwischen 0,5-.0.7 für die unten beschriebenen Phagen Isolierungs- und Reinigungsverfahren / Schritten bestehen.

2. Sammlung von Phagen von Bodenproben

1. Sammeln Sie 200 bis 400 g Boden vom gewünschten Ort. Anmerkung: Da Bakterien im Arthrobacter Gattung sind gemeinsame Bodenbakterien sie und die Phagen, die sie infizieren können in gefunden werden und sind allgegenwärtig in den meisten Bodenarten.
2. Hinzufügen mindestens 400 ml Phagenpuffer (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO _4, 10 mM Tris-CL (pH 7,5)], um den Boden und mischt in einem ausreichend großen Kolben, so dass mindestens 200 ml PB im Überstand und kann entnommen werden.
3. Mischen Sie durch leichtes Rühren oder wirbeln, bis der Boden ausgesetzt ist, und lassen Sie die Bodensedimente zu begleichen, in der Regel 30 Minuten.
4. Übergeben Sie die "Bodenextrakt" durch Filterpapier durch Schwerkraftfiltration Bodensediment Schmutz zu entfernen.
5. Fügen LB Pulver und mischen, um eine 2% ige Lösung (4 g LB-Pulver in 200 ml Bodenextrakt) zu machen.
6. Übergeben Sie die Lösung durch ein 0,22 um-Filter durch Vakuumfiltration, um ein steriles Filtrat zu erhalten. Wenn möglich, fahren Sie sofort mit Schritt 2.7. Falls erforderlich, zu speichern filtrierten Proben bei 4 ° C für bis zu einer Woche vor dem Fortfahren, jedoch die Anzahl von lebensfähigen Phagenpartikelnwird reduziert.
7. Aliquoten mehrere 50 ml des filtersterilisiert LB / Bodenextrakt Mischung in einzelne 250 ml sterilisierte Schütteln verblüfft Kulturflaschen unter aseptischen Bedingungen. In sterilen 2,0 M CaCl _{2 -Lösung,} um den gewünschten endgültigen Konzentrationen (0-50 mM), da verschiedene Arthrobacter Phagen optimal wachsen unter verschiedenen _CaCl2 Bedingungen.
   HINWEIS: Wir finden, dass die Mehrzahl der Arthrobacter Phagen von uns erkannt liegen im Bereich von 1 mM bis 2,5 mM CaCl _2. Mehrere der isolierten Phagen wuchs jedoch von uns ausschließlich bei 0 mM CaCl ₂ .oder bei sehr hohen CaCl _{2 -Konzentrationen.} Gehen Sie sofort zu Schritt 3.1.

3. Phage Isolation

1. Hinzufügen von 1 zu 2,5 ml von späten exponentiellen / frühen stationären Phase Bakterienkultur auf jeden der Kolben. Bei einer OD ₆₀₀ von 0,5 bis 0,7, verwenden Sie 1 ml der Zellen. Für eine OD ₆₀₀ höher als eine OD von 0,7 In 2,5 mlZellen.
   Hinweis: Zellen im exponentiellen Phase Wachstum ergeben in der Regel mehr Phagen und höhere Titer als Zellen in der stationären Phase Wachstum.
2. Schüttelflaschen mit 250 Upm bei 30 ° C für etwa 24 Stunden in einem Schüttelinkubator.
3. Nach einer 24-Stunden Inkubationszeit entfernen Anreicherungskolben aus dem Schüttelinkubator und verdünnt das Anreicherungs Proben Zehnfache im Phagenpuffer.
4. Bis Kulturröhrchen mit 0,5 ml späten exponentiellen / frühen stationären Phase Bakterienkultur gesetzt sind und verschiedene Mengen des Anreicherungskultur (5 ul bis 500 ul einer 10 ^-1 Verdünnung in PB) zu den Kulturröhrchen.
   HINWEIS: Es ist ratsam, einen weiten Konzentrationsbereich zu testen, da jeder Bodenprobe erzeugt verschiedene Phagentiter nach Anreicherung.
5. Fügen _CaCl2 zu Kulturröhrchen eine endgültige Konzentration gleich im Original Anreicherungskolben der vorliegenden Konzentration zu machen. Verwenden Sie eine Reihe von verschiedenen CaCl _{2 -Konzentrationen} für viele Phagen w wählenith unterschiedlichen _CaCl2 Abhängigkeiten.
   HINWEIS: Die meisten Phagen innerhalb des _CaCl2 Bereich von 1-2,5 mM isoliert werden, aber es gibt Phagen am optimalsten überall 0-50 mM CaCl _{2 -Konzentrationen} isoliert. Aus diesem Grund empfiehlt es sich, eine Reihe von CaCl _{2 -Konzentrationen} zu überprüfen, um die Anzahl der eindeutigen isoliert Arthrobacter Phagen zu maximieren.
6. Mischungs 4,5 ml LB-Topagar im Kulturrohr und gießt die Mischung auf einem LB-Agar-Platte. Vorsichtig schwenken, um über die Platte gleichmäßig zu verteilen und ermöglichen eine Top-Agar für etwa 15 Minuten zu festigen.
   HINWEIS: Top-Agar in größeren Chargen (250 ml) und zusätzliche Top-Agar hergestellt werden können bei RT gespeichert und für nachfolgende Experimente wiederverwendet für mindestens zwei Wochen werden. Zwar gibt es verschiedene Formeln verwendet werden, um Top-Agar, machen wir Top-Agar mit 7 g / l Agar mit LB. gemischt Ort Topagar in einem 60 ° C Wasserbad auf den flüssigen Zustand während des Verlaufs des Experiments beibehalten.
7. Invert ter Inkubieren bei gewünschter Temperatur (Temperatur bis 30 ° C) O / N bis 48 hr. Variieren diese Bedingungen für die vorliegenden Phagen zu optimieren. Die meisten isolierten Phagen stammen aus Platten bei 30 ° C bei 1 bis 2,5 mM _{CaCl2-Konzentration} nach 24 h Inkubationszeit inkubiert.

4. Phage Reinigung

1. Nach einer 24-stündigen Inkubation Check für Plaquebildung auf Platten. Weiter Inkubation bis zu 72 h, wenn keine Plaques sind offensichtlich oder um festzustellen, ob zusätzliche Plaques erscheinen. Falls erforderlich, speichern Platten mit vermeintlichen Plaques für bis zu einer Woche bei 4 ° C, bevor Sie fortfahren.
   HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, dass eine Vielzahl von verschiedenen Morphologien Plaque auf einer Platte zu finden. Auffinden Plaques nach 3 Tagen der Inkubation ist möglich, aber selten.
2. Reinige gewünschten Phagen aus klar getrennt Plaques mit dem Streifen Plaque-Methode. Berühren Sie eine Plakette mit einer sterilen Holzstab. Streak die Plaque, indem Sie einen Holzstab durch eine Flamme, allowing der Stick kurz abkühlen, und dann reiben Sie den Stick auf der Agar-Platte in der sanften Bewegung, wie in Abbildung 1 dargestellt. mit einem sauberen Stick für jeden Durchgang Wiederholen Sie diesen Vorgang.
3. Alternativ können Sie die traditionellen Plaque-Titer-Test für einzelne Phagenplaques zu isolieren. Die Plaque-Titer-Assay erfordert die Verwendung von mehr Reagenzien wie LB-Agar und LB-Topagar und Materialien wie Petrischalen für Phagenplaqueisolierung. Wir waren sehr erfolgreich mit dem Streifen Plaque-Methode, aber es ist technisch einfacher, einzelne Plaques mit Hilfe des Plaque-Titer-Test zu isolieren.
4. Sobald der LB-Agarplatte wird mindestens dreimal ausgestrichen, markieren den Bereich mit der niedrigsten Konzentration der putative Phagenpartikel und sanft an 0,5 ml Arthrobacter und 4,5 ml geschmolzener Deckagar LB (die die gleiche Konzentration von Calciumchlorid als Mutterplatte ) und lassen Sie es gleichmäßig über die Platte verteilt.
5. Invertieren und Inkubation Platte O / N. Wiederholen Sie den Streifen PlaqueTechnik für mindestens drei Iterationen, um eine reine Phagen-Arten zu gewährleisten ist isoliert. Speicher-Platten bei 4 ° C für bis zu einer Woche zwischen Streifen Bedarf ohne erheblichen Verlust an Phagen Lebensfähigkeit.
6. Sobald die gewünschte Plaques worden sind, und auf der letzten Streifen der Platte getrennt, berühren Sie einen gut isolierten Plaque mit einer Mikropipette Spitze und resuspendieren in 100 ul PB. Seriell verdünnt diese Lösung 10 ⁰ aus, um die 10 ^-8 Verdünnung, indem 20 ul der Probe in 180 ul frischem PB.
7. Zugabe von 10 ul jeder Verdünnung auf 0,5 ml gezüchtet Arthrobacter in ein Kulturröhrchen für 5 bis 10 min bei RT und der Platte hergestellt, indem die infizierten Bakterien mit 4,5 ml geschmolzenen LB-Deckagar, enthaltend die gleiche Konzentration an CaCl ₂ verwendet, um den Phagen zu isolieren, von der ursprünglichen Bodenprobe. Speichern Sie alle Verdünnungen bei 4 ° C bis zum nächsten Tag gemacht.
8. Bestimmen Sie die Phagenverdünnungs benötigt, um eine Web-Muster mit der herkömmlichen Plaque-Titer, wie machensagen sie mal. Der Zweck der Plaque-Titer-Assay ist, um den Phagen-Titer benötigt, um eine Bahn-Musterplatte zu erhalten, zu bestimmen. Identifizieren Sie einen Web-Musterplatte als überwiegend frei von Bakterien, sondern enthält Reste der Bakterien, die noch nicht von Phagen lysiert wurden. 5 ml späten exponentiellen / frühen stationären Arthrobacter Kultur in ein steriles 50 ml Kulturflasche.
   1. Füge 100 ul der Verdünnung (das gab ein Netzmuster auf die Arthrobacter-Kultur) in den Kulturbehälter und ermöglichen, dass die Phagen an die Bakterienzellen für 5 bis 10 min bei RT infizieren. Mischen mit geschmolzenem LB-Deckagar, enthaltend die gleiche Konzentration an CaCl _2, wie verwendet, um den Phagen zunächst zu identifizieren und die Platte 5 ml dieser Mischung auf 10 frische LB-Platten. Erstarren lassen und Inkubation umgekehrten Platten bei 30 ° C.
9. Am nächsten Tag, durchfluten die Web-Modellplatten mit 5 ml PB und speichern O / N bei 4 ° C oder 4 Stunden bei Raumtemperatur.
10. Filtern des Phagenlysats durch ein 0,22 um-Spritzenfilterund bei 4 ° C. Muss diese letzte Phagenvorrat für weitere Experimente, wie Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Phagenpartikeln, Phagen Isolierung genomischer DNA für DNA-Restriktionsenzym-Analyse und Sequenzierung unter Verwendung von Standardverfahren. Für langfristige Lagerung des Phagen Lager, fügen Sie eine gleiche Menge des Phagen-Lysats auf steriles Glycerin in kleine Fläschchen für Lager Archivierung bei -80 ° C.
    HINWEIS: Für alle, die nicht mit dieser Phagen-Techniken erfahren, ist eine großartige Ressource die Online zugänglich www.phagesdb.org Website.

Ergebnisse

Um die Reproduzierbarkeit der verbesserte Anreicherungsverfahrens für Arthrobacter Phagen zu zeigen, wurden 30 verschiedene Bodenproben zu verschiedenen Zeiten und Orten im Frühjahr und Sommer 2014. Von diesen 30 Bodenproben einzigartige Arthrobacter Phagen wurden aus 22 der gesammelten Bodenproben mit dieser Bereicherung erhalten verwendet Verfahren. Die Standardanreicherungsverfahren ergab eindeutige Phagen von 3 der gleichen Bodenproben. Die Anreicherung Proben eine sehr hohe Phagentiter benötige...

Diskussion

Trotz vieler bisherigen Versuche, Phagen infizieren kann Arthrobacter Hosts zu isolieren, wir hatten wenig Erfolg mit Standard-Anreicherungsverfahren. Das verallgemeinerte Verfahren zur Bakterienanreicherung entwickelt und von van Twest und Kropinskis ¹⁰ angepasst, um Phagen aus Umweltproben reichern bleibt die Grundlage für die Mehrheit der Anreicherungsverfahren. Erkenntnisse aus früheren Studien legt nahe, dass Methoden der direkten Beschichtung haben nachweisbaren Plaques auf Stämme von Ar...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 mL pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 mL conical tubes	Fisher	76002844
15 mL conical tubes	Fisher	76002845
10 mL pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 mL pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824