Una técnica de enriquecimiento optimizado para el aislamiento de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriófago Especies de Aísla Muestra de Suelo

Resumen

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Resumen

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Introducción

La ubicuidad de las especies Arthrobacter en entornos de suelo ofrece un gran número y diversidad de fagos capaces de ser aislado a partir de esta especie de bacteria huésped. Miembros bacterianas de la familia Acintobacteriaceae son más notables por sus vías catabólicas de degradar compuestos recalcitrantes como la atrazina y varios otros pesticidas y herbicidas ^1,2,3. Aunque la mayoría de investigaciones se ha hecho uso de cepas ambientales de Arthrobacter, aislados clínicos de este género se encuentran en la sangre, la orina, los ojos y muchas otras fuentes humanas que muestran toda la heterogeneidad filogenético ^4.

Si bien no es un lugar amplio cuerpo de investigación sobre bacterias Arthrobacter, sólo unos pocos estudios informan sobre los fagos capaces de infectar a los miembros de este diverso género. Curiosamente, sin embargo, el trabajo realizado previamente en Arthrobacter fagos toques sobre varios temas clave diferenciadas, como la tipificación de suelo especies Arthrobacter ^5, usos industriales con el fin de reducir la espuma perjudicial en las plantas de tratamiento de lodos activados ^6, y el trabajo destacando recombinación específica de sitio y los genes de la integrasa ^7.

Varios protocolos técnica de enriquecimiento se han empleado para generar pura fago aísla en especies de Arthrobacter. Los primeros procedimientos incluyen incubaciones de suelo con agentes tóxicos adicionales como sales de nicotina durante períodos de más de un año ⁸ dando lugar a los fagos capaces de infectar sólo A. globiformis. Los estudios realizados utilizando suelo percola con productos orgánicos lábiles parecían producir fagos detectables a través de técnicas de ensayo de placa, omitiendo largos períodos de incubación ^8. Curiosamente, sin embargo, se utilizó una técnica parecida a la siembra directa en el pasado dando lugar a varios fagos mientras que todavía tiene una baja tasa de éxito particular por los investigadores ^5, citando estudios anteriores con bajas tasas de éxito 8.

En general, las técnicas de aislamiento utilizados en el pasado eran destaca por tener poca eficacia en la práctica a pesar de género Arthrobacter que representan el suelo aeróbico más común aislar en la naturaleza ^4,9,, Van Twest y Kropinski ¹⁰ presentes métodos de enriquecimiento para el aislamiento de fagos a partir de agua y el suelo adaptado de técnicas anteriores utilizadas para enriquecer aislamientos bacterianos ambientales, pero estas técnicas de enriquecimiento resultó ineficaz en el aislamiento de los fagos Arthrobacter. El propósito del método descrito aquí es mostrar "prueba de concepto" que los métodos de enriquecimiento primeros pueden ser adaptados para aislar de manera consistente y eficaz fagos Arthrobacter, la superación de dificultades técnicas anteriores asociadas con el aislamiento de fagos de este género bacteriano.

Protocolo

1. Preparación de las células para el aislamiento de fagos Arthobacter

• Arthrobacter Cultura sp. KY3901 colonias estrías en una Luria Bertaini (LB) placa de agar se incubaron a 30 ° C durante 2-3 días. Escoja una colonia y utilizar un asa estéril para añadirlo a 250 ml de caldo LB en un matraz de cultivo desconcertado e incubar en una incubadora de agitación a 225 rpm a 30 ° C.
• Deje aproximadamente 24 h de crecimiento para obtener células en fase exponencial finales / temprana estacionarias para experimentos de infección del fago. Supervisar el estado de crecimiento bacteriano de cerca para evitar que las células entren en el medio y tardío estado de crecimiento estacionario.
  NOTA: El crecimiento celular debe consistir en una densidad óptica OD ₆₀₀ entre 0,5-aproximadamente 0.7 para los procedimientos de aislamiento y purificación de fagos / pasos descritos a continuación.

2. Recopilación de fagos de muestras de suelo

1. Reúna 200-400 g de suelo desde la ubicación deseada. Nota: Puesto que las bacterias en la Arthrobagénero CTER son bacterias comunes del suelo y que los fagos que infectan a ellos se pueden encontrar en y son omnipresentes en la mayoría de los tipos de suelo.
2. Añadir al menos 400 ml de tampón de fago (PB) [NaCl 68 mM, 10 mM MgSO _4, 10 mM Tris-CL (pH 7,5)] para el suelo y mezclar en un matraz lo suficientemente grande como para que al menos 200 ml de PB es en el sobrenadante y es capaz de ser extraído.
3. Mezcle por agitación o agitación suave hasta que se suspendió el suelo y permitir que el sedimento del suelo se asiente, típicamente 30 min.
4. Pase el "extracto de tierra" a través de papel de filtro por filtración por gravedad para eliminar los restos de sedimentos del suelo.
5. Añadir polvo de LB y mezclar para obtener una solución al 2% (4 g LB en polvo en 200 ml de extracto de suelo).
6. Pasar la solución a través de un filtro de 0,22 micras por filtración a vacío para obtener un filtrado estéril. Si es posible, continúe con el paso 2.7 inmediatamente. Si es necesario, la tienda filtra muestras a 4 ° C durante un máximo de una semana antes de continuar, sin embargo, el número de partículas de fagos viablesse reducirá.
7. Alícuota de múltiples porciones de 50 ml de la mezcla de extracto de LB / suelo esterilizada por filtración en individuales 250 ml esterilizados agitando los matraces de cultivo utilizando técnicas asépticas con deflectores. Añadir M CaCl solución estéril 2,0 ₂ a las concentraciones finales deseadas (0-50 mm) desde diferentes fagos Arthrobacter crecen óptimamente en diferentes CaCl ₂ condiciones.
   NOTA: Nos encontramos con que la mayoría de los fagos Arthrobacter identificados por nosotros están dentro del rango de 1 mM-2,5 mM _CaCl2. Sin embargo, varios de los fagos aislados crecieron por nosotros exclusivamente a 0 mM CaCl ₂ .o a muy altas concentraciones de CaCl _2. Proceda inmediatamente al paso 3.1.

Aislamiento 3. Fago

1. Añadir 1 a 2,5 ml de cultivo de bacterias estacionaria tardía fase exponencial / temprano para cada uno de los matraces. Para una DO ₆₀₀ 0,5-0,7, utilice 1 ml de células. Para un OD ₆₀₀ mayor que un diámetro exterior de 0,7 utilizar 2,5 ml delas células.
   NOTA: Las células en fase de crecimiento exponencial típicamente producen más fagos y los títulos más altos que las células en fase estacionaria del crecimiento.
2. Agite matraces a 250 rpm a 30 ° C durante aproximadamente 24 horas en un incubador con agitación.
3. Después de un período de incubación de 24 hr eliminar matraces de enriquecimiento de la incubadora de agitación y diluir las muestras de enriquecimiento de diez veces en tampón de fago.
4. Establecer tubos de cultivo con 0,5 ml de cultivo de bacterias estacionaria tardía fase exponencial / temprano y añadir diversas cantidades del cultivo de enriquecimiento (5 l a 500 l de una dilución 10 ^-1 en PB) a los tubos de cultivo.
   NOTA: Es recomendable probar una amplia gama de concentraciones ya que cada muestra de suelo genera diferentes títulos de fagos después del enriquecimiento.
5. Añadir CaCl ₂ a tubos de cultivo para hacer una concentración final igual a la concentración presente en el matraz de enriquecimiento inicial. Utilice una gama de diferentes concentraciones de CaCl ₂ para seleccionar para muchos fagos wi-ésima variable CaCl ₂ dependencias.
   NOTA: La mayoría de los fagos serán aislados dentro de la gama de _CaCl2 de 1 a 2,5 mM pero hay fagos aislados más óptima en cualquier lugar 0-50 mM CaCl ₂ concentraciones. Debido a esto lo mejor es comprobar una serie de CaCl ₂ concentraciones de maximizar el número de fagos únicos Arthrobacter aisladas.
6. Mezclar 4,5 ml de agar superior LB en el tubo de cultivo y verter la mezcla sobre una placa de agar LB. Agitar suavemente para distribuir a través de la placa de manera uniforme y permitir agar superior solidificar durante aproximadamente 15 min.
   NOTA: Top agar se puede preparar en grandes lotes (250 ml) y agar superior adicional se puede almacenar a temperatura ambiente y se reutiliza para experimentos posteriores durante al menos dos semanas. Aunque existen diferentes fórmulas utilizadas para hacer subir Agar, hacemos subir Agar utilizando 7 g / l de agar mezclado con LB. Top agar Colocar en un baño de agua a 60 ° C para conservar el estado líquido durante el curso de un experimento.
7. Invertir tél placa e incubar a temperatura deseada (temperatura a 30 ° C) O / N a 48 h. Vary estas condiciones para optimizar los fagos presentes. La mayoría fagos aislados provienen de placas se incubaron a 30 ° C en 1-2,5 mM CaCl concentración ₂ después de un período de incubación de 24 horas.

4. Los fagos Purificación

1. Después de una verificación de incubación de 24 h para la formación de placa en placas. Continuar la incubación durante un máximo de 72 horas si no hay placas son evidentes o para determinar si van a aparecer placas adicionales. Si es necesario, las placas, almacenarlas con placas putativos para hasta una semana a 4 ° C antes de continuar.
   NOTA: No es raro encontrar una variedad de diferentes morfologías de placa en un plato. Encontrar placas después de 3 días de incubación es posible pero poco frecuente.
2. Purificar fagos deseados de placas claramente aislados utilizando el método de la placa racha. Toque una placa con un palo de madera estéril. Racha de la placa mediante la ejecución de un palo de madera a través de una llama, allowing el palo para enfriar brevemente, y luego frotando el palo en la placa de agar en el movimiento suave como se muestra en la Figura 1. Repita este usando un palo limpio para cada pasada.
3. Como alternativa, utilice el ensayo de valoración placa tradicional para aislar placas de fagos individuales. El ensayo de valoración de placa requiere el uso de más reactivos tales como agar LB y agar superior LB y materiales tales como placas de Petri para el aislamiento de placas de fagos. Hemos tenido un gran éxito con el método de la placa racha pero es técnicamente más fáciles de aislar placas individuales utilizando el ensayo de valoración de la placa.
4. Una vez que la placa de agar LB se raya al menos tres veces, marcar el área con la concentración más baja de partículas de fago putativo y aplique suavemente 0,5 ml de Arthrobacter y 4,5 ml de agar superior LB fundido (que contiene la misma concentración de cloruro de calcio como la placa matriz ) y deje que se distribuye uniformemente en toda la placa.
5. Invierta la placa e incubar O / N. Repita la placa rachase aísla técnica para al menos tres iteraciones para garantizar una especie de fagos puros. Placas se almacenan a 4 ° C durante hasta una semana, según sea necesario entre rayas y sin pérdida significativa de la viabilidad del fago.
6. Una vez que las placas deseados se han cultivado y aislado en la placa racha final, tocar un pozo aislado placa con una punta de la micropipeta y volver a suspender en 100 l PB. En serie diluir esta solución 10 ⁰ a la dilución 10 ^-8 haciendo pasar 20 l de la muestra en 180 l de PB fresco.
7. Añadir 10 l de cada dilución a 0,5 ml de Arthrobacter crecido en un tubo de cultivo de 5 a 10 min a TA y la placa mediante la mezcla de las bacterias infectadas con 4,5 ml de agar superior LB fundido que contiene la misma concentración de CaCl ₂ usado para aislar el fago de la muestra original del suelo. Guarde todas las diluciones hechas a 4 ° C hasta el día siguiente.
8. Determinar la dilución en serie fago necesaria para hacer un patrón web utilizando el título de la placa tradicionaldecir. El propósito del ensayo es el título de la placa para determinar el título del fago se necesita para obtener una placa patrón de web. Identificar un patrón placa web como la mayoría desprovisto de bacterias, pero que contengan restos de bacterias que aún no han sido lisadas por los fagos. Añadir 5 ml de la cultura Arthrobacter estacionaria exponencial / principios del XX a un matraz de cultivo de 50 ml estéril.
   1. Añadir 100 l de la dilución (que dio un patrón de web a la cultura Arthrobacter) en el matraz de cultivo y permitir que los fagos para infectar las células de las bacterias de 5 a 10 min a TA. Mezclar con agar superior LB fundido que contiene la misma concentración de CaCl ₂ tal como se utiliza para identificar inicialmente el fago y la placa 5 ml de esta mezcla sobre 10 placas de LB fresco. Dejar solidificar e incubar las placas invertidas a 30 ° C.
9. Al día siguiente, inundar las placas modelo web con 5 ml de PB y tienda de O / N a 4 ° C o 4 horas a temperatura ambiente.
10. Filtrar el lisado de fago a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrasy almacenar a 4 ° C. Utilice esta fago final para experimentos adicionales, tales como imágenes de microscopía electrónica de partículas de fago, fago aislamiento de ADN genómico para el análisis con enzimas de restricción y secuenciación de ADN genómico utilizando procedimientos estándar. Para el almacenamiento a largo plazo de la población de fagos, añadir una cantidad igual del lisado del fago a glicerol estéril en frascos pequeños para la acción de archivado a -80 ° C.
    NOTA: Para los que no experimentado con estas técnicas de fagos, un gran recurso es el sitio web en línea www.phagesdb.org accesible.

Resultados

Para demostrar la reproducibilidad de la técnica de enriquecimiento mejorado para fagos Arthrobacter, se utilizaron 30 muestras de suelo diferentes en diferentes momentos y lugares durante la primavera y el verano de 2014. De estos 30 muestras de suelo fagos Arthrobacter únicas se obtuvieron a partir de 22 muestras de suelo recogidas mediante este enriquecimiento procedimiento. El procedimiento de enriquecimiento estándar produjo fagos únicos de 3 de las mismas muestras de suelo. Las muestras de en...

Discusión

A pesar de muchos intentos anteriores para aislar fagos capaces de infectar ordenadores Arthrobacter, tuvimos poco éxito utilizando procedimientos de enriquecimiento estándar. El método generalizado de enriquecimiento bacteriana desarrollado y adaptado por van Twest y Kropinski ¹⁰ para enriquecer fagos a partir de muestras ambientales sigue siendo la base para la mayoría de procedimientos de enriquecimiento. La evidencia de estudios previos sugieren que los métodos de siembra directa han produci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 mL pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 mL conical tubes	Fisher	76002844
15 mL conical tubes	Fisher	76002845
10 mL pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 mL pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824