一种优化富集技术的隔离<em&gt;节杆菌</em&gt;噬菌体种从土壤样品隔离

摘要

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

摘要

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

引言

节杆菌种在土壤环境中无处不在提供能够从这种寄主细菌被噬菌体分离出一个庞大的数量和多样性。在Acintobacteriaceae家族的细菌成员是最显着的降低顽固的化合物，如莠去津和其他各种杀虫剂和除草剂^1,2,3他们的代谢途径。虽然大多数研究已经完成使用的节杆菌菌株环境，本属临床分离株血，尿，眼睛，和其他许多人来源的所有显示系统发育不均匀⁴找到。

虽然有相当广泛的对节杆菌的细菌研究机构，只有少数研究能够感染这种多样化属成员的噬菌体报告。但有趣的是，在此前节杆菌所做的工作噬菌体几个关键的不同的主题接触，如土壤类型节杆菌物种^5，工业用途以减少有害的泡沫在活性污泥处理厂⁶和工作突出位点特异性重组和整合基因⁷的目的。

各种富集技术协议已被利用来产生纯的噬菌体分离物在节杆菌物种。早期的程序包括土壤添加了有毒物质尼古丁一样的盐每年超过⁸引起的时期孵化到能够只感染A的噬菌体球形节杆菌 。研究使用的土壤渗出完成与不稳定的有机物经出现斑块检测技术，生产检测噬菌体，省略了漫长的潜伏期^8。但有趣的是，一个类似的技术直接电镀用在过去的几个噬菌体引起同时还具有一个显着低成功率的调查^5，理由是低成功率过去的研究 8。

总体而言，在过去所用的分离技术是值得注意的具有尽管节杆菌属的代表最常见的有氧土壤在实践中很少功效隔离性质的^4,9，，范Twest和Kropinski ¹⁰本富集方法用于从水和土壤中分离的噬菌体改编自用于充实环境的细菌菌株，但这些富集技术的早期技术被证明效率低下的隔离节杆菌噬菌体。这里所描述的方法的目的是要表明"概念验证"，早期的富集方法可以适于一致地和有效地隔离节杆菌噬菌体，克服了与来自该细菌属中分离的噬菌体相关的先前的技 ​​术挑战。

研究方案

1.制备Arthobacter细胞对噬菌体分离

• 培养节杆菌。KY3901菌落划线上的Luria Bertaini（LB）琼脂平板上培养，在30℃下进行2-3天。选择一个菌落并使用无菌环到它在225转添加250ml的LB肉汤中在带挡板的培养瓶中，并培育在振荡培养箱中于30℃。
• 允许约24小时的生长，得到迟指数/早期静止期细胞噬菌体感染实验。监测细菌生长的状态密切以防止细胞进入到中间后期静止生长状态。
  注意:细胞生长应0.5-.0.7对于下面描述的噬菌体的分离和纯化步骤/步骤之间包括一个光密度OD _600。

从土壤样品2.收集噬菌体

1. 收集200-400克土壤所需的位置。注:由于细菌在ArthrobaCTER属是常见的土壤细菌，他们和他们感染的噬菌体中可以找到并普遍存在于大多数类型的土壤。
2. 添加到土壤至少400毫升噬菌体缓冲液（PB）[68 mM氯化钠，的10mM _硫酸镁 ，10毫摩尔Tris-CL（pH为7.5）]，并混合在一个足够大的烧瓶，使至少200毫升的PB是在上清液中，并能够被提取。
3. 轻轻搅拌或涡旋直至土壤悬浮混合，并且允许在土壤沉积物沉降，一般为30分钟。
4. 通过重力过滤通过"土壤提取物"，通过过滤纸，除去泥沙土屑。
5. 添加LB粉末并混合，使2％的溶液（4克的LB粉末在200毫升土壤提取物）。
6. 通过真空过滤通过0.22微米过滤的溶液，得到的无菌滤液。如果可能的话，请继续，立即步骤2.7。可行的噬菌体颗粒，如果需要的话，店内过滤样品在4℃长达一个星期前进行，然而，数会降低。
7. 多个等分试样（每份50ml）的过滤灭菌的LB /土壤提取物的混合物的成单个250毫升灭菌摇使用无菌技术挡板的培养瓶中。因为不同的节杆菌噬菌体不同的CaCl ₂的条件下生长最佳添加无菌的2.0M的CaCl ₂溶液至最终所需的浓度（0-50毫米）。
   注意:我们发现，多数确定我们的节杆菌噬菌体的是为1mM-2.5mM的氯化钙₂的范围内。然而，一些孤立的噬菌体的增长我们专门在0毫米氯化钙_2。或者在非常高的_氯化钙浓度。立即进行步骤3.1。

3.噬菌体隔离

1. 加12.5毫升晚指数/早期稳定期细菌培养物到每个烧瓶。对于OD ₆₀₀从0.5-0.7，使用1毫升细胞。对的OD ₆₀₀高于0.7的OD使用将2.5ml细胞。
   注:指数生长期细胞通常产生更多的噬菌体和更高的滴度比细胞静止期增长。
2. 在振荡培养箱摇瓶中以250rpm在30℃下大约24小时。
3. 经过24小时的潜伏期从摇床删除富集瓶和稀释的浓缩样品十倍噬菌体缓冲。
4. 建立培养管0.5下旬指数/早期固定相细菌培养毫升，加入不同量的富集培养（5微升至500微升10 ^-1稀释PB），以文化管。
   注意:最好是测试各种浓度的，因为每个土样富集后会产​​生不同的噬菌体滴度。
5. 加入_氯化钙至培养管，使最终浓度等于存在于原始富集烧瓶浓度。使用一定范围的不同的CaCl ₂浓度的选择用于许多噬菌体瓦特第i个不同的_氯化钙的依赖。
   注:大多数噬菌体将在_氯化钙范围1-2.5毫米之内孤立的，而是有噬菌体中分离最优化的任何地方从0-50毫米氯化钙₂浓度。因为这一点，最好是检查范围的CaCl ₂浓度最大化的独特分离节杆菌的噬菌体的数目。
6. 混合4.5毫升的LB顶层琼脂中培养管，将混合物倾到的LB琼脂板上。轻轻摇动整个板均匀地分布，并允许上层琼脂凝固约15分钟。
   注:顶部琼脂可以在较大的批量（250毫升）和附加的顶层琼脂制备可以存储在RT并再用于随后的实验中，至少有两个星期。虽然有用来使顶层琼脂不同的公式，我们使上层琼脂使用7克/ L琼脂的LB中与混合在60℃的水浴代替顶层琼脂的实验过程中保持液态。
7. 反转吨他板和孵化在所需温度（温度为30°C）O / N为48小时。改变这些条件进行优化为存在的噬菌体。最孤立的噬菌体来自一个24小时的潜伏期后，培养在30℃1-2.5毫米氯化钙₂浓度板。

4.净化噬菌体

1. 经过24小时培养检查平板上斑块的形成。继续温育长达72小时，如果没有斑块是显而易见的，或以确定是否附加的噬菌斑出现。如果需要的话，店里板的假定斑块长达一个星期在4℃之前，诉讼的。
   注:这是不难发现各种不同的斑块形态的一个板块。孵化后3天发现斑块是可能的，但很少见。
2. 净化使用条纹斑点法明确孤立斑块预期的噬菌体。触摸牌匾用无菌木棍。连胜斑块通过火焰运行木棍，allowin克棒简单冷却，然后擦在琼脂平板在柔和的运动的棒， 如图1。使用清洁棒对各遍重复此。
3. 另外，使用传统的牌匾滴度检测，以分离单个噬菌斑。噬菌斑测定法滴度确实需要使用多种试剂，如LB琼脂和LB顶层琼脂和材料如培养皿噬菌体斑块隔离。我们已经非常成功使用条纹菌斑的方法，但它在技术上是容易分离使用噬菌斑的滴度测定个体斑块。
4. 一旦在LB琼脂平板上划线接种是在至少三次，马克与推定的噬菌体颗粒的最低浓度的区域，并轻轻申请0.5毫升节杆菌和4.5毫升的LB熔融顶层琼脂（含有氯化钙的相同浓度的父板），并允许它均匀地分布在整个板。
5. 反转，并培育板O / N。重复连胜牌匾技术至少三次迭代，以确保一个纯噬菌体物种是分离的。商店板在4℃下进行长达一周需要条纹之间不显著损失噬菌体生存能力。
6. 一旦需要的斑块已经发展壮大，孤立的最终连胜板，触摸一体以及孤立的牌匾用枪头，重新悬浮于100微升PB。串联通过使20微升样品放入180微升新鲜稀释的PB这10 ⁰的溶液出到10 ^-8稀释。
7. 在培养管中进行5加10微升每种稀释液以0.5 节杆菌生长毫升至室温10分钟，板通过混合感染的细菌具有4.5的含_氯化钙的相同浓度用于分离噬菌体熔融的LB上层琼脂毫升从原来的土样。保存发在4°C，直到第二天的所有稀释。
8. 确定需要做出采用传统的牌匾滴度为web模式的噬菌体连续稀释说了。菌斑的滴度测定的目的是确定需要获得一个web图案板的噬菌体效价。识别网页模板的大多是缺乏细菌，但包含尚未通过裂解噬菌体细菌的残余。加入5 ml后期指数/早期固定节杆菌培养到无菌的50ml培养瓶中。
   1. 添加100微升的稀释液（即给一个web图案的节杆菌培养物）中培养瓶，并允许噬菌体感染的细菌细胞进行5至10分钟，在RT。混合使用作为用于最初鉴定噬菌体和板5毫升该混合物到10新鲜LB平板含有_氯化钙的相同浓度的熔融的LB琼脂顶部。允许固化并孵育倒置平板，于30℃。
9. 第二天，洪水幅图案板用5ml PB和商店O / N的，在4℃或4小时，在室温。
10. 通过0.22微米的注射器过滤器过滤该噬菌体裂解物并存储在4℃。使用此最终噬菌体股票为另外的实验，如噬菌体颗粒的电子显微镜图像，噬菌体基因组DNA分离为使用标准程序DNA的限制酶分析和基因组测序。对于长期储存的噬菌体股票，噬菌体裂解液等量的小药瓶股票归档于-80℃加入到无菌甘油。
    注:对于那些没有经历过这些噬菌体技术，一个巨大的资源是在线访问www.phagesdb.org网站。

结果

为了证明对节杆菌噬菌体改进富集技术的再现，2014年这些独特的节杆菌噬菌体从采集的土壤样品22使用这种浓缩获得30土壤样品的春季和夏季期间，30个不同的土壤样品用于在不同的时间和地点流程。标准的富集过程产生独特的噬菌体3相同的土壤样品。所述富集的样品可具有非常高的噬菌体滴度需要初始稀释以分离斑块或相对低的噬菌体滴度要求富集的节杆菌的较大体积成功?...

讨论

尽管许多以前曾试图孤立能够感染主机节杆菌噬菌体的，我们有一点成功使用标准的浓缩过程。细菌富集开发并适于通过面包车Twest和Kropinski ¹⁰从环境样品富集的噬菌体的广义方法仍是依据对大多数富集过程。从以往的研究证据表明，直接电镀的方法都对节杆菌菌株的检测斑块尽管有隔离⁵的成功率极低。与直接镀法，噬菌体是从土壤样品中提取噬菌体缓冲和过滤，以...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 mL pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 mL conical tubes	Fisher	76002844
15 mL conical tubes	Fisher	76002845
10 mL pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 mL pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824