Una tecnica di arricchimento Ottimizzato per l&#39;isolamento di<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Batteriofago Specie campione di terreno Isolati

Riepilogo

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Abstract

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Introduzione

L'ubiquità di specie Arthrobacter in ambienti di terreno offre un vasto numero e la diversità dei fagi che possono essere isolati da questa specie di batteri ospiti. Membri batteriche della famiglia Acintobacteriaceae sono più notevole per i loro percorsi catabolici di degradare composti recalcitranti come l'atrazina e vari altri pesticidi e diserbanti ^1,2,3. Sebbene la maggior parte della ricerca è stata effettuata utilizzando ceppi ambientali di Arthrobacter, isolati clinici di questo genere si trova nel sangue, urine, gli occhi, e molte altre fonti umane tutte espongono eterogeneità filogenetico ^4.

Mentre vi è un corpo piuttosto ampio di ricerche sui batteri Arthrobacter, solo pochi studi riportano sui fagi capaci di infettare i membri di questo genere vario. Interessante notare, però, il lavoro fatto in precedenza su Arthrobacter fagi tocca diversi argomenti distinti chiave come la tipizzazione del suolo specie Arthrobacter ^5, usi industriali con lo scopo di ridurre la schiuma deleterio in attivati ​​impianti di trattamento dei fanghi ^6, e il lavoro evidenziando ricombinazione sito specifico e geni integrasi ^7.

Vari protocolli tecnica di arricchimento sono stati impiegati per generare pura fagi isolati nelle specie Arthrobacter. Procedure I primi comprendono incubazione del terreno con l'aggiunta di agenti tossici, come i sali di nicotina per periodi di oltre un anno ⁸ dando luogo a fagi capaci di infettare solo A. globiformis. Studi condotti utilizzando terreno percolati con sostanze organiche labili sembravano produrre fagi rilevabili attraverso tecniche di analisi della placca, omettendo i periodi di incubazione lunghi ^8. Interessante notare, però, una tecnica simile a semina diretta è stata utilizzata in passato ha dato origine a diversi fagi, pur avendo un tasso di successo notevolmente basso dagli investigatori ^5, citando studi precedenti con basse percentuali di successo ^8.

In generale, le tecniche di isolamento utilizzate in passato sono stati notevoli per avere poca efficacia nella pratica, nonostante le genere Arthrobacter rappresentano il terreno aerobico più comune isolare in natura ^4,9,, Van Twest e Kropinski ¹⁰ attuali metodi di arricchimento per isolare i fagi da acqua e suolo adattato dalle tecniche precedenti utilizzate per arricchire isolati batterici ambientali, ma queste tecniche di arricchimento dimostrato inefficiente a isolare fagi Arthrobacter. Lo scopo del metodo qui descritto è quello di mostrare "proof of concept", che i metodi di arricchimento primi possono essere adattati per isolare in modo coerente ed efficace fagi Arthrobacter, superando precedenti sfide tecniche associate a isolare fagi da questo genere di batteri.

Protocollo

1. Preparazione di cellule Arthobacter per Phage Isolation

• Cultura Arthrobacter sp. KY3901 colonie striati su Luria Bertaini (LB) piastra agar incubata a 30 ° C per 2-3 giorni. Scegli una colonia e utilizzare un'ansa sterile per aggiungerlo a 250 ml di brodo LB in un pallone di coltura sconcertato e incubare in un incubatore agitazione a 225 rpm a 30 ° C.
• Lasciare circa 24 ore di crescita per ottenere cellule in fase esponenziale fine / inizio stazionarie per esperimenti di infezione fagi. Monitorare lo stato di crescita batterica strettamente per evitare che le cellule di entrare nel centro di stato di crescita stazionaria tardiva.
  NOTA: la crescita delle cellule deve essere composto da un OD densità ottica _{di 600} tra 0,5 .0.7 per le procedure di isolamento fago e purificazione / passaggi di seguito descritti.

2. Raccolta dei fagi da campioni di suolo

1. Raccogliere 200-400 g di suolo da posizione desiderata. Nota: Poiché i batteri nel Arthrobagenere CTER sono batteri del suolo comuni che e fagi che li infettano possono trovare in e sono presenti in quasi tutti i tipi di terreno.
2. Aggiungere almeno 400 ml di Phage Buffer (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO _4, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5)] al terreno e miscelare in un matraccio abbastanza grande in modo che almeno 200 ml di PB è nel surnatante ed è in grado di essere estratto.
3. Mescolare agitando o agitando delicatamente fino a quando il terreno è sospeso e lasciare il sedimento terreno di stabilirsi, di solito 30 min.
4. Passare il "estratto terreno" su carta da filtro per filtrazione a gravità per rimuovere i detriti detriti sedimenti.
5. Aggiungere la polvere LB e miscelare per ottenere una soluzione al 2% (4 g LB polvere in 200 ml di estratto suolo).
6. Far passare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron per filtrazione sotto vuoto per ottenere un filtrato sterile. Se possibile, passare alla fase 2.7 immediatamente. Se del caso, conservare i campioni filtrati a 4 ° C per una settimana prima di procedere, tuttavia, il numero di particelle fagiche vitalisarà ridotto.
7. Aliquota più 50 ml di miscela di estratto LB / terreno filtro sterilizzato in singole da 250 ml sterile agitando cultura palloni sconcertato utilizzando tecniche asettiche. Aggiungere sterile M CaCl soluzione 2.0 ₂ alle concentrazioni finali desiderati (0-50 mm) in quanto diversi fagi Arthrobacter crescono in modo ottimale in diverse CaCl ₂ condizioni.
   NOTA: Troviamo che la maggioranza dei fagi Arthrobacter individuati da noi sono all'interno della gamma di 1 mM-2.5 mM CaCl _2. Tuttavia, molti dei fagi isolati cresciuto da noi esclusivamente a 0 mM CaCl ₂ .o ad altissima CaCl ₂ concentrazioni. Procedere immediatamente al punto 3.1.

3. Phage isolamento

1. Aggiungere 1 e 2,5 ml di ritardo esponenziale / inizio stazionaria coltura batterica di fase a ciascuno dei flaconi. Per un OD ₆₀₀ 0,5-0,7, utilizzare 1 ml di cellule. Per una OD ₆₀₀ superiore un OD di 0,7 utilizzare 2,5 ml dicellule.
   NOTA: Le cellule in fase di crescita esponenziale in genere producono più fagi e titoli superiori rispetto alle cellule in crescita fase stazionaria.
2. Agitare beute a 250 rpm a 30 ° C per circa 24 ore in un incubatore agitazione.
3. Dopo un periodo di incubazione 24 ore rimuovere fiaschi di arricchimento dal termostato scuotimento e diluire i campioni di arricchimento di dieci volte in tampone fago.
4. Istituito tubi di coltura con 0,5 ml di ritardo esponenziale / inizio stazionario coltura batterica di fase e aggiungere diverse quantità di coltura di arricchimento (5 ml a 500 ml di una diluizione 10 ^-1 in PB) ai tubi di coltura.
   NOTA: Si consiglia di testare una vasta gamma di concentrazioni dal momento che ogni campione di suolo genera diversi titoli fagi dopo arricchimento.
5. Aggiungere CaCl ₂ per provette di coltura per effettuare una concentrazione finale pari alla concentrazione presente nel pallone arricchimento originale. Utilizzare una gamma di CaCl ₂ concentrazioni di selezionare per molti fagi wesima variabile CaCl ₂ dipendenze.
   NOTA: La maggior parte dei fagi saranno isolati all'interno della gamma CaCl ₂ di 1-2,5 mm, ma ci sono fagi isolati più in modo ottimale ovunque 0-50 mM CaCl ₂ concentrazioni. Per questo motivo è meglio controllare una gamma di CaCl ₂ concentrazioni per massimizzare il numero di unici isolati fagi Arthrobacter.
6. Mescolare 4,5 ml di LB top agar nel tubo cultura e versare il composto su una piastra di agar LB. Agitare delicatamente per distribuire attraverso la piastra in modo uniforme e consentire top agar a solidificare per circa 15 min.
   NOTA: Top agar può essere preparato in lotti più grandi (250 ml) e top agar extra può essere conservato a temperatura ambiente e riutilizzato per successivi esperimenti per almeno due settimane. Anche se ci sono diverse formule utilizzate per fare top agar, facciamo top agar utilizzando 7g / L di agar mescolato con LB. Inserire superiore agar in un bagno di acqua 60 ° C per mantenere allo stato liquido durante il corso di un esperimento.
7. Inverti tegli piastra e incubare a temperatura desiderata (temperatura di 30 ° C) O / N a 48 hr. Vary queste condizioni per ottimizzare i fagi attuali. Fagi più isolati provengono da piastre incubate a 30 ° C a 1-2.5 CaCl ₂ mM concentrazione dopo una incubazione di 24 ore.

4. Phage Purificazione

1. Dopo un controllo di incubazione 24 ore per la formazione della placca sui piatti. Continuare l'incubazione per un massimo di 72 ore se non placche sono evidenti o per determinare se appariranno targhe supplementari. Se necessario, le piastre negozio con targhe putativi per un massimo di una settimana a 4 ° C prima di procedere.
   NOTA: Non è raro trovare una varietà di differenti morfologie placca su una piastra. Trovare placche dopo 3 giorni di incubazione è possibile ma rara.
2. Purificare fagi desiderati da placche chiaramente isolati con il metodo striscia targa. Toccare una targa con un bastone di legno sterile. Streak la targa eseguendo un bastone di legno con una fiamma, allowing bastone raffreddare brevemente, e poi strofinando il bastone sulla piastra di agar nel moto dolce come mostrato in Figura 1. Ripetere questo utilizzando uno scovolo per ogni passaggio.
3. In alternativa, utilizzare il tradizionale saggio di placca titolo di isolare i singoli placche fagi. Il saggio di placca titolo richiede l'uso di più reattivi come LB agar LB e superiore agar e materiali come piastre Petri per l'isolamento fago placca. Abbiamo avuto un grande successo con il metodo striscia targa ma è tecnicamente più facile isolare singole placche utilizzando il saggio di placca titolo.
4. Una volta che la piastra di agar LB è striata almeno tre volte, segnare l'area con la più bassa concentrazione di particelle fagiche putativi e delicatamente applicano 0,5 ml di Arthrobacter e 4,5 ml di LB agar fuso superiore (contenente la stessa concentrazione di cloruro di calcio come la piastra madre ) e permettono di diffondere in modo uniforme in tutto il piatto.
5. Capovolgere e incubare piastra O / N. Ripetere la targa strisciatecnica per almeno tre iterazioni per assicurare una specie fagi puri è isolato. Conservare le piastre a 4 ° C per un massimo di una settimana, se necessario tra strisce senza una significativa perdita di redditività fago.
6. Placche volta desiderati sono stati coltivati ​​e isolato sul piatto striscia finale, toccare uno ben isolato targa con una punta micropipetta e risospendere in 100 microlitri PB. Serialmente diluire questa soluzione 10 ⁰ fuori della diluizione 10 ^-8 passando 20 microlitri del campione in 180 ml ​​di PB fresco.
7. Aggiungere 10 ml di ciascuna diluizione di 0,5 ml di Arthrobacter cresciuto in una provetta per 5 a 10 min a temperatura ambiente e la piastra mescolando i batteri infettati con 4,5 ml di LB agar fuso superiore contenente la stessa concentrazione di CaCl ₂ utilizzati per isolare il fago dal campione originale suolo. Salvare tutte le diluizioni effettuate a 4 ° C fino al giorno successivo.
8. Determinare la diluizione in serie fago necessario per fare un modello web utilizzando il tradizionale titolo placcadire. Lo scopo del saggio di placca titolo è determinare il titolo fago necessario per ottenere una placca modello web. Identificare un modello piastra tela come in gran parte privi di batteri, ma contenente resti di batteri che non sono ancora stati lisati per fagi. Aggiungere 5 ml di cultura Arthrobacter stazionario esponenziale / inizio tardi per un 50 ml pallone di coltura sterile.
   1. Aggiungere 100 ml di diluizione (che ha dato un modello web alla cultura Arthrobacter) nel pallone di coltura e permettono fagi di infettare le cellule batteriche per 5 a 10 minuti a RT. Mescolare con fusa superiore agar LB contenente la stessa concentrazione di CaCl ₂ come utilizzato per identificare inizialmente fago e piastra 5 ml di questa miscela su 10 piastre LB fresco. Lasciar solidificare ed incubare le piastre capovolte a 30 ° C.
9. Il giorno successivo, inondare le placche modello web con 5 ml di PB e negozio O / N a 4 ° C o 4 ore a temperatura ambiente.
10. Filtrare il lisato fago attraverso un filtro siringa da 0,22 microne conservare a 4 ° C. Utilizzare questo fago magazzino finale per ulteriori esperimenti come le immagini di microscopia elettronica di particelle dei fagi, fago isolamento DNA genomico per l'analisi di restrizione del DNA enzima e il sequenziamento genomico utilizzando le procedure standard. Per la conservazione a lungo termine del fago magazzino, aggiungere una quantità uguale di lisato fago di glicerolo sterile in piccole fiale per azione archiviazione a -80 ° C.
    NOTA: Per chi non sperimentato con queste tecniche fagi, una grande risorsa è il sito online www.phagesdb.org accessibili.

Risultati

Per dimostrare la riproducibilità della tecnica di arricchimento migliorata per fagi Arthrobacter, 30 diversi campioni di terreno sono stati utilizzati in tempi e luoghi diversi durante la primavera e l'estate del 2014. Di questi campioni di suolo 30 fagi Arthrobacter unici sono stati ottenuti da 22 campioni di terreno raccolti utilizzando questo arricchimento procedura. La procedura standard di arricchimento prodotto fagi unici da 3 degli stessi campioni di suolo. I campioni di arricchimento poss...

Discussione

Nonostante i molti precedenti tentativi di isolare i fagi in grado di infettare gli host Arthrobacter, abbiamo avuto poco successo utilizzando le procedure di arricchimento standard. Il metodo generalizzato di arricchimento batterica sviluppato e adattato da van Twest e Kropinski ¹⁰ per arricchire fagi da campioni ambientali resta la base per la maggior parte delle procedure di arricchimento. Prove da studi precedenti suggeriscono che i metodi di placcatura diretta hanno prodotto placche rilevabili s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 mL pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 mL conical tubes	Fisher	76002844
15 mL conical tubes	Fisher	76002845
10 mL pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 mL pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824