Une technique d&#39;enrichissement Optimisé pour l&#39;isolement de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bactériophage Espèces de l&#39;échantillon du sol Isole

Résumé

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Résumé

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Introduction

L'omniprésence des espèces Arthrobacter dans des environnements de sol offre un grand nombre et la diversité des phages susceptibles d'être isolé de cette espèce de bactéries hôtes. Bactériennes membres de la famille Acintobacteriaceae sont les plus notables pour leurs voies cataboliques de dégrader des composés récalcitrants comme l'atrazine et d'autres pesticides et herbicides ^1,2,3. Bien que la plupart des recherches ont été faites en utilisant des souches environnementales de Arthrobacter, isolats cliniques de ce genre se trouve dans le sang, l'urine, les yeux, et de nombreuses autres sources humaines tout une hétérogénéité phylogénétique ^4.

Bien qu'il existe un corps plutôt vaste de la recherche sur les bactéries Arthrobacter, seules quelques études signalent sur ​​les phages capables d'infecter les membres de ce genre diversifié. Fait intéressant cependant, le travail fait précédemment sur ​​Arthrobacter phages touches sur plusieurs sujets distincts clés tels que le typage du sol espèces Arthrobacter ^5, les utilisations industrielles dans le but de réduire la mousse délétère dans les usines de traitement des boues activées ^6, et le travail en soulignant recombinaison spécifique de site et les gènes de l'intégrase ^7.

Divers protocoles de technique d'enrichissement ont été employées pour générer des isolats de phage pur dans les espèces Arthrobacter. Les premières procédures comprennent incubations de sol avec des agents toxiques ajoutés comme les sels de nicotine pour des périodes de plus d'un an donnant lieu à ⁸ phages capables de ne infecter A. globiformis. Des études effectuées en utilisant le sol percole avec des matières organiques labiles semblent produire des phages détectables par des techniques d'analyse plaque, en omettant longues périodes d'incubation ^8. Fait intéressant cependant, une technique qui ressemble à ensemencement direct a été utilisé dans le passé donnant lieu à plusieurs phages tout en ayant un taux de réussite particulièrement faible par les enquêteurs ^5, citant des études passées avec faibles taux de réussite 8.

Dans l'ensemble, les techniques d'isolation utilisés dans le passé ont été remarquables pour avoir peu d'efficacité dans la pratique malgré les genre Arthrobacter représentant le sol aérobie la plus courante isoler dans la nature ^4,9, Van Twest et Kropinski ¹⁰ méthodes d'enrichissement présents pour isoler les phages de l'eau et du sol adapté de techniques antérieures utilisées pour enrichir isolats bactériens environnementaux, mais ces techniques d'enrichissement se est avéré inefficace à isoler phages Arthrobacter. Le but de la méthode décrite ici est de montrer "preuve de concept" que les méthodes d'enrichissement début peuvent être adaptés pour isoler cohérente et efficace phages Arthrobacter, surmonter les défis techniques associés à isoler précédentes phages de ce genre bactérien.

Protocole

1. Préparation des cellules pour Arthobacter Phage Isolement

• Culture Arthrobacter sp. KY3901 colonies striées sur une Luria Bertaini (LB) plaque de gélose incubées à 30 ° C pendant 2-3 jours. Choisissez une colonie et utiliser une boucle stérile pour l'ajouter à 250 ml de bouillon LB dans un flacon de culture perplexe et incuber dans un incubateur sous agitation à 225 tours par minute à 30 ° C.
• Laisser environ 24 h de la croissance pour obtenir fin des cellules en phase stationnaire exponentielles / début pour des expériences d'infection de phage. Surveiller l'état de la croissance bactérienne étroitement pour empêcher les cellules de pénétrer dans le milieu à la fin l'état stationnaire de croissance.
  NOTE: La croissance cellulaire devrait être composé d'une densité optique OD ₆₀₀ de 0,5-.0.7 pour les procédures d'isolement et de purification de phages / étapes décrites ci-dessous.

2. Collecte des phages d'échantillons de sol

1. Rassemblez 200-400 g de sol de l'emplacement souhaité. Remarque: Comme les bactéries dans le Arthrobagenre Cter sont des bactéries du sol et les communes qu'ils phages qui les infectent peuvent être trouvés dans et sont omniprésents dans la plupart des types de sol.
2. Ajouter au moins 400 ml de tampon de phage (PB) [mM de NaCl 68 mM _MgSO4 10, 10 mM de Tris-Cl (pH 7,5)] pour le sol et les mélanger dans un grand ballon suffisamment pour qu'au moins 200 ml de PB est dans le surnageant et est apte à être extrait.
3. Mélanger par agitation ou remuant doucement jusqu'à ce que le sol est suspendu et laisser les sédiments du sol pour se installer, généralement 30 min.
4. Passez le "extrait de sol" à travers un papier filtre par filtration par gravité pour éliminer les débris sédiments du sol.
5. Ajouter la poudre LB et mélanger pour obtenir une solution à 2% (4 g de poudre LB dans 200 ml d'extrait sol).
6. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um par filtration sous vide pour obtenir un filtrat stérile. Si possible, passez à l'étape 2.7 immédiatement. Si besoin est, magasin filtré échantillons à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine avant de continuer, cependant, le nombre de particules de phages viablessera réduite.
7. Aliquote multiples portions de 50 ml du mélange d'extrait LB / sol stérilisée par filtration dans individuels de 250 ml stérilisés secouant flacons de culture dérouté aide de techniques aseptiques. Ajouter stérile 2,0 M CaCl ₂ solution aux concentrations finales souhaitées (0-50 mm) depuis différents phages Arthrobacter croissent de manière optimale dans différentes conditions de CaCl _2.
   REMARQUE: On constate que la majorité des phages Arthrobacter sont identifiés par nous dans la plage de 1 mM à 2,5 mM, CaCl _2. Cependant, plusieurs des phages isolés ont augmenté par nous exclusivement à 0 mM _CaCl2 .ou à de très hautes concentrations de CaCl _2. Procéder immédiatement à l'étape 3.1.

3. Isolation Phage

1. Ajouter 1 à 2,5 ml de retard fixe culture de bactéries en phase exponentielle / début de chacun des flacons. Pour une DO ₆₀₀ de 0,5 à 0,7, utiliser 1 ml de cellules. Pour une DO ₆₀₀ supérieure à une DO de 0,7 utiliser 2,5 ml decellules.
   REMARQUE: Les cellules en phase de croissance exponentielle donnent généralement plus de phages et des titres plus élevés que les cellules de la croissance de la phase stationnaire.
2. Secouez flacons à 250 tours par minute à 30 ° C pendant environ 24 heures dans un incubateur à agitation.
3. Après une période d'incubation de 24 h retirer flacons enrichissement de l'incubateur secouant et diluer les échantillons d'enrichissement de dix fois dans le tampon de phage.
4. Mettre en place des tubes de culture avec 0,5 ml de retard fixe culture de bactéries en phase exponentielle / début et ajouter diverses quantités de la culture d'enrichissement (5 ul à 500 ul d'une dilution à 10 ^-1 PB) aux tubes de culture.
   NOTE: Il est conseillé de tester une large gamme de concentrations puisque chaque échantillon de sol génère différents titres de phages après enrichissement.
5. Ajouter CaCl ₂ pour des tubes de culture pour rendre une concentration finale égale à la concentration présente dans le ballon de l'enrichissement initial. Utilisez une gamme de différents CaCl ₂ concentrations de sélectionner pour nombreux phages wCaCl ₂ ième variable dépendances.
   REMARQUE: La plupart des phages seront isolés dans la plage de 1 à 2,5 CaCl ₂ mm, mais il ya des phages isolés plus optimale partout 0-50 mM CaCl ₂ concentrations. Pour cette raison, il est préférable de vérifier une gamme de CaCl ₂ concentrations de maximiser le nombre de phages uniques Arthrobacter isolés.
6. Mélanger 4,5 ml d'agar LB dans le tube de culture et versez le mélange sur une plaque de gélose LB. Agiter doucement pour répartir uniformément sur la plaque et permettre top agar se solidifier pendant environ 15 min.
   REMARQUE: Top agar peut être préparé en lots plus importants (250 ml) et top agar supplémentaire peut être conservé à température ambiante et réutilisé pour des expériences ultérieures pendant au moins deux semaines. Bien qu'il existe différentes formules utilisées pour faire agar dessus, nous faisons top agar en utilisant 7g / L d'agar mélangé avec LB. agar Placez dans un bain-marie à 60 ° pour conserver l'état liquide au cours d'une expérience.
7. Inverser til plaque et incuber à la température souhaitée (température à 30 ° C) O / N à 48 h. Vary ces conditions pour optimiser les phages présents. Phages plus isolées proviennent de plaques ont été incubées à 30 ° C à 1 à 2,5 mM CaCl concentration ₂ après une période d'incubation de 24 h.

4. Phage Purification

1. Après un contrôle d'incubation de 24 heures pour la formation de plaque sur des plaques. Continuer incubation jusqu'à 72 heures si aucune plaques sont évidentes ou pour déterminer si des plaques supplémentaires apparaîtront. Si nécessaire, des plaques de magasins avec plaques putatifs pour jusqu'à une semaine à 4 ° C avant de procéder.
   NOTE: Il ne est pas rare de trouver une variété de différentes morphologies de la plaque sur une plaque. Trouver plaques après 3 jours d'incubation est possible, mais rare.
2. Purifier phages souhaités de plaques clairement isolé en utilisant la méthode de la plaque de série. Touchez une plaque avec un bâton en bois stérile. Streak la plaque en exécutant un bâton en bois à travers une flamme, allowing le bâton pour refroidir brièvement, puis frotter le bâton sur la plaque de gélose dans le mouvement doux comme le montre la figure 1. Répétez cette aide d'un bâton propre pour chaque passage.
3. Vous pouvez également utiliser le dosage traditionnelle plaque de titre pour isoler plaques de phages individuels. La plaque de dosage titre exige l'utilisation de plusieurs réactifs tels que l'agar LB et LB agar supérieur et des matériaux tels que des boîtes de Pétri pour l'isolement de la plaque de phage. Nous avons eu beaucoup de succès en utilisant la méthode de la plaque de série, mais il est techniquement plus facile à isoler plaques individuelles en utilisant le test de la plaque titre.
4. Une fois que la plaque de gélose LB est striée au moins trois fois, marquer la zone avec la plus faible concentration de particules de phage putatifs et appliquer doucement 0,5 ml d'Arthrobacter et 4,5 ml de top agar fondu LB (contenant la même concentration de chlorure de calcium comme la plaque mère ) et lui permettre de se répandre uniformément sur la plaque.
5. Inversez et incuber la plaque O / N. Répétez la plaque de sérietechnique pendant au moins trois itérations pour assurer une espèce de phage pur est isolé. plaques de conserver à 4 ° C pour jusqu'à une semaine selon les besoins entre les stries sans perte significative de la viabilité du phage.
6. Une fois plaques souhaités ont été cultivées et isolé sur la plaque de série finale, touchez une plaque bien isolée avec une pointe de micropipette et remettre en suspension dans 100 pi de PB. Série diluer cette solution à 10 ⁰ à la dilution 10 ^-8 en passant 20 pi de l'échantillon dans 180 pl de PB frais.
7. Ajouter 10 ul de chaque dilution de 0,5 ml de cultivé Arthrobacter dans un tube de culture pendant 5 à 10 min à la température ambiante et la plaque en mélangeant les bactéries infectées avec 4,5 ml de top agar LB fondu contenant la même concentration de CaCl ₂ utilisé pour isoler les phages de l'échantillon de sol d'origine. Enregistrer toutes les dilutions faites à 4 ° C jusqu'au lendemain.
8. Déterminer la dilution en série de phage nécessaire pour faire un modèle Web en utilisant le titre de plaque traditionnelledire. Le but de l'essai de plaque de titrage est de déterminer le titre de phage nécessaire pour obtenir une plaque-modèle Web. Identifier une plaque de motif de forme Web comme la plupart du temps mais dépourvu de bactéries contenant des restes de bactéries qui ne ont pas encore été lysées par les phages. Ajouter 5 ml de la culture exponentielle / début fin Arthrobacter fixe à une culture de 50 ml flacon stérile.
   1. Ajouter 100 ul de la dilution (qui a donné un motif de bande de la culture de Arthrobacter) dans le flacon de culture et de permettre aux phages pour infecter les cellules bactériennes pendant 5 à 10 min à température ambiante. Mélanger avec le dessus de la gélose LB fondu contenant la même concentration de CaCl ₂ comme initialement utilisé pour identifier le phage et la plaque 5 ml de ce mélange sur 10 plaques LB frais. Laisser solidifier et incuber les plaques inversées à 30 ° C.
9. Le lendemain, inonder les plaques modèles Web avec 5 ml de PB et stocker O / N à 4 ° C ou 4 heures à température ambiante.
10. Filtrer le lysat de phage à travers un filtre à seringue de 0,22 umet stocker à 4 ° C. Utilisez ce phage finale stock pour des expériences supplémentaires tels que des images de microscopie électronique de particules de phage, phage isolement de l'ADN génomique pour l'analyse de restriction enzyme ADN et le séquençage génomique en utilisant des procédures standard. Pour le stockage à long terme du stock de phages, ajouter un montant égal du lysat de phage glycérol stérile dans de petites fioles pour le stock archivage à -80 ° C.
    NOTE: Pour ceux qui ne expérience avec ces techniques de phage, une grande ressource est le site de www.phagesdb.org accessible en ligne.

Résultats

Pour démontrer la reproductibilité de la technique d'enrichissement amélioré pour phages Arthrobacter, 30 échantillons de sol différents ont été utilisés à différents moments et les lieux au cours du printemps et de l'été 2014. Parmi ces échantillons 30 de sol phages Arthrobacter uniques ont été obtenus à partir de 22 échantillons de sol prélevés en utilisant cet enrichissement procédure. La procédure d'enrichissement donné norme phages uniques à partir de trois de c...

Discussion

Malgré de nombreuses tentatives antérieures afin d'isoler les phages capables d'infecter des hôtes Arthrobacter, nous avons eu peu de succès en utilisant des procédures d'enrichissement standard. La méthode généralisée de l'enrichissement bactérienne développé et adapté par van Twest et Kropinski ¹⁰ pour enrichir phages partir d'échantillons environnementaux demeure la base de la majorité des procédures d'enrichissement. Les résultats d'études précédent...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 mL pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 mL conical tubes	Fisher	76002844
15 mL conical tubes	Fisher	76002845
10 mL pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 mL pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824