التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة

Wikrom Wongpaiboonwattana; Marios P. Stavridis

doi:10.3791/52823

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Abstract

القدرة على تمييز الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) إلى الأسلاف العصبية تسمح دراسة آليات السيطرة على مواصفات العصبية فضلا عن جيل من أنواع الخلايا العصبية الناضجة لمزيد من الدراسة. في هذا البروتوكول وصفنا طريقة لتمايز ESC إلى الأسلاف العصبية باستخدام المصل خالية والثقافة أحادي الطبقة. هذه الطريقة قابلة للوكفاءة ويؤدي إلى إنتاج ~ 70٪ الخلايا الاصلية العصبية داخل 4-6 أيام. ويمكن تطبيقه على ESC من مختلف السلالات التى تزرع في إطار مجموعة من الشروط. يمكن السماح الأسلاف العصبية إلى مزيد من التفريق في الخلايا العصبية الوظيفية والدبقية أو تحليلها بواسطة المجهر، وتدفق تقنيات الخلوي أو الجزيئية. عملية التمايز هو قابل للالوقت الفاصل بين المجهر ويمكن الجمع مع استخدام خطوط مراسل لمراقبة عملية مواصفات العصبية. نحن نقدم تعليمات مفصلة حول إعداد وسائل الاعلام وكثافة الخلايا الأمثل للسماح للعملية بالبريد تطبيقها على معظم خطوط ESC ومجموعة متنوعة من السفن ثقافة الخلية.

Introduction

الخلايا الجذعية الجنينية هي الخلايا المحفزة المستمدة من الجنين في وقت مبكر لديها القدرة على التكاثر إلى أجل غير مسمى في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا الكبار بعد إعادة إلى الجنين مرحلة المناسب (خلال تشكيل كايميرا)، والحقن في مسانج أو نقص المناعة المضيفين (من خلال تشكيل مسخي) أو في المختبر تخضع لمنبهات المناسبة ^1. وكان أول وصف التمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية في الأنساب العصبية في عام 1995 وشملت تشكيل المجاميع تعليق الخلايا (الهيئات مضغي، EBS) في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل تستكمل مع حمض الريتينويك محدثة التخلق ^2-4. ومنذ ذلك الحين تم تطوير مجموعة متنوعة من البروتوكولات للسماح التمايز العصبي ^5. لا يزال كثير من الاستفادة من التجميع، شارك في ثقافة الآخرين مع إحداث أنواع الخلايا وعدد تنطوي على استخدام المصل خالية سائل الإعلام. جميع البروتوكولات لديها مزايا علىالثانية عيوب والطبيعة المحددة لالعصبية أو الخلايا العصبية تنتج أيضا يختلف وفقا لبروتوكول المستخدمة.

وأضاف أن البروتوكول المثالي هو أن يكون قويا، للتحجيم والاستفادة من وسائل الإعلام وركائز محددة تماما، تكون قابلة للرصد غير الغازية لعملية التمايز ويؤدي إلى توليد السكان نقية من الأسلاف العصبية قادرة على أن تكون منقوشة بواسطة منبهات الخارجية والتفريق في جميع أنواع فرعية العصبية والدبقية مع الكفاءة العالية والعائد في وقت قصير نسبيا. في اثني عشر عاما الماضية لقد تم استخدام طريقة لتوليد الأسلاف العصبية والخلايا العصبية من الماوس ESC في منخفض الكثافة، والثقافة أحادي الطبقة ملتصقة خالية من المصل ^10/06. هذا البروتوكول يحقق العديد من المعايير الواردة أعلاه: في أيدينا فإن كفاءة التمايز يتسق تماما على مدى سنوات عديدة ومتنوعة من خطوط الخلايا، فإنه يمكن زيادتها إلى أعلى أو أسفل (التي نستخدمها بنجاح السفن من لوحات 96-جيدا ل 15 سم القطر ديشيس) وسائل الإعلام المستخدمة هي واضحة المعالم. هذه العملية هي قابلة للالمجهر timelapse لرصد التمايز ومجموعة متنوعة من العظة الزخرفة ويمكن أن يضاف للحث على توليد أنواع متميزة من الأنواع الفرعية العصبية (على سبيل المثال، Shh على وFgf8 عن الخلايا العصبية الدوبامين ^6).

ومع ذلك، هناك بعض التحديات التي تواجه التطبيق الناجح لهذا البروتوكول. أحد الجوانب الرئيسية لإعداد دقيق وسائل الإعلام. نحن دائما بتحضير وسائل الإعلام في المنزل على الرغم من توافر البدائل التجارية. واحدة من المكملات الغذائية المستخدمة (N2؛ انظر البروتوكول) لديها تعديلات على مستوى الإصدارات المتوفرة تجاريا. أخيرا، واحدة من أهم الخطوات لنجاح تطبيق هذا الأسلوب هو كثافة الخلية المثلى في الطلاء. هذا هو السبب الرئيسي في حين تتطلب طبيعة autocrine واحدة من الإشارات المحفزة (Fgf4 ¹¹⁾ أن خلايا كافية موجودة للسماح viabil الأمثلهو ضعف إيتي والتمايز، بكثافات عالية جدا التمايز (ربما يرجع ذلك جزئيا إلى إنتاج autocrine من LIF ^12). ولذلك فمن المهم أن إعداد كل من وسائل الإعلام وطلاء الخلية تتم بعناية وباستمرار لضمان أفضل النتائج.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام

ملاحظة: بروتوكول يعتمد على استخدام مزيج من اثنين منفصلة وسائل الإعلام: DMEM / F12 تستكمل مع تعديل الملحق N2 وNeurobasal تستكمل مع B27 الملحق، وعادة في نسبة 1: 1.

إعداد N2 ملحق تعديل عن طريق خلط المكونات في أنبوب 15 مل. لا الدوامة أو تصفية هذا؛ مزيج من قبل قلب الأنبوب حتى حل واضح.
1. بدء بواسطة pipetting 7.2 مل من DMEM / F12، ثم يضاف 1 مل من 25 ملغ / مل الأنسولين (تتكون في 0.01 M حمض الهيدروكلوريك) ومزيج جيد من قبل قلب الأنبوب. يستغرق بضع دقائق حتى حل واضح.
2. إضافة 1 مل من 100 ملغ / مل APO-ترانسفيرين (تتكون في الماء)، 33 ميكرولتر من 0.6 ملغ / مل progesternone (تتكون في الإيثانول)، و 100 ميكرولتر من 160 ملغ / مل (1 M) بوتريسين (تتكون في الماء )، و 10 ميكرولتر من 3 ملي سيلينات الصوديوم (تتكون في الماء) و 666 ميكرولتر من 7.5٪ ألبومين المصل البقري وتخلط الأنبوب جيدا. قسامة إلى 2.5 مل وتخزينها في -20 °C لمدة تصل إلى 2 أشهر.
إعداد وسائل الإعلام.
1. 250 مل من DMEM / F12 إضافة 2.5 مل من N2. تخلط جيدا ولكن لا تهزه أو التصفية.
2. 250 مل من Neurobasal وسائل الإعلام إضافة 5 مل من B27 الملحق. تخلط جيدا ولكن لا تهزه أو التصفية.
3. خلط وسائل الإعلام من خطوات 1.2.1 و 1.2.2 في نسبة 1: 1. في بعض الحالات 1: قد تكون هناك حاجة مزيج 3 (تستكمل مثل 1: مزيج 1 في الخطوة 1.2.4).
4. إلى المزيج إضافة 0.5 مل من L-الجلوتامين (تركيز النهائي 0.2 ملم) و 3.5 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول (تركيز النهائي 0.1 ملم) وتخلط جيدا دون أن تهتز. تخزين وسائل الإعلام في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع، وتجنب تعريض للضوء. ويسمى هذا المزيج النهائي N2B27.
تحضير محلول الجيلاتين.
1. إعداد محلول الجيلاتين 1٪ في الماء عالى النقاء والتعقيم في 121 ° C، 15 رطل، لمدة 15 دقيقة. من المهم أن الزجاجة المستخدمة لهذا نظيفة تماما من المنظفات أو المطهرات، لذلك فمن المستحسن أن زجاجة الجديدةتستخدم لهذا وفقط من أي وقت مضى تشطف في الماء عالى النقاء بين الاستخدامات. قسامة الحل 1٪ إلى 50 مل قسامات والحفاظ على 4 درجات مئوية لمدة أشهر.
2. تدفئة قسامة من 1٪ الجيلاتين في 37 ° C حمام الماء حتى يذوب وإضافة إلى 500 مل من الفوسفات مخزنة المالحة الدافئة (PBS). تخلط جيدا والماصة بما يكفي لتغطية الجزء السفلي من كل بئر أو لوحة. السماح الجيلاتين إلى معطف السطح لمدة 30 دقيقة على الأقل.

2. طلاء الخلايا

ملاحظة: ينطبق هذا البروتوكول أيضا على الماوس ESC تزرع في 10٪ مصل مع عامل مثبط سرطان الدم (LIF)، واستبدال المصل مع LIF أو وسائل الإعلام خالية من المصل مع LIF ومخلق العظام البروتين 4 (BMP4) أو منظمة مجاهدي خلق وGSK3 مثبطات (وسائل الإعلام 2I) مع أو بدون LIF. ومع ذلك، فإن توقيت وكفاءة التمايز قد تختلف اعتمادا على وسائل الإعلام والخلايا (انظر المناقشة). لالتجارب هو موضح هنا استخدمنا خط 46C الماوس ESC (الذي لديه طرقت مراسل EGFP إلى سشمال شرق من الأليلات Sox1 الذاتية)، ونمت في GMEM مع 10٪ مصل وLIF. لأفضل النتائج من المهم أن الخلايا فصلها وreplated في وسائل الإعلام N2B27. ببساطة تغيير وسائل الإعلام من GMEM / المصل / LIF إلى N2B27 يؤدي دائما في انخفاض الكفاءة التمايز مقارنة replating الخلايا.

تنمو الخلايا في GMEM مع المصل 10٪، 1 ملي البيروفات الصوديوم، والأحماض الأمينية غير الأساسية 1X و 0.1 M 2-المركابتويثانول، و 100 وحدة / مل LIF ^13. للحصول على الثقافة subconfluent من الماوس ESC، لوحة 1 × 10 ⁶ الخلايا في قارورة الثقافة T25 والتي سوف تتخذ 2-3 أيام.
مراقبة الخلايا تحت المجهر مشرق الميدان. عندما كانت الخلايا subconfluent وعلى استعداد للمرور، شطف لهم مرتين في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من خلية تفارق كاشف والعودة إلى الحاضنة لمدة 2-5 دقيقة. على الرغم من التربسين والأنزيمات الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا لتفكك خلية، فإنها يمكن أن يكون لها تأثير سلبي على مرفق الخلية وبالتالي فإن كثافة الطلاء سوف تحتاج إلى أن تكون adjuSTED.
وبمجرد أن الخلايا هي بداية لرفع من لوحة، والاستفادة من السفينة إلى إخراجهم إلى تعليق خلية واحدة. جمع الخلايا في ما مجموعه 10 مل من وسائل الإعلام والتفكك خلية الكاشف والماصة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 3 دقائق على RT.
نضح بعناية طاف و resuspend بيليه في 10 مل من قبل تحسنت N2B27 pipetting صعودا وهبوطا 3-5 مرات. عندما pipetting لتعليق أسفل، الماصة ضد الجانب من الأنبوب لتجنب خلق فقاعات. عد الخلايا مع عداد خلية الآلي أو haemocytometer وتسجيل التركيز.
إعداد تعليق الخلية التي تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا لكل وحدة من وحدة التخزين إلى أن مطلي لكل بئر في درجة حرارة ما قبل N2B27. A كثافة 10500 خلية لكل سم ² في صحن 6 جيدا (أي 1 × 10 ⁵ خلايا لكل بئر من صحن 6 جيدا) هو الأمثل. انظر الجدول رقم 1 لالعدد المقترح من الخلايا لكل سم ² وجيش التحرير الشعبى الصينىوحدات التخزين وسائل الإعلام تينغ لمجموعة متنوعة من السفن ثقافة الخلية.
نضح الجيلاتين من سفينة الثقافة وصفيحة تعليق الخلية وفقا للكثافة المقترحة وحجم في الجدول 1. لا يدوم لوحات حيث سيؤدي ذلك إلى تركيز الخلايا إلى المركز. وضع الثقافات في حاضنة الرطبة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
تغيير وسائل الاعلام كل 1-2 أيام عن طريق استبدال جميع وسائل الإعلام مع N2B27 الطازجة. ماصة بلطف كما بيغ الخلايا قد يؤثر على كثافة ويقلل من كفاءة التمايز في الأيام التالية. حيث الجدوى الأولية بعد الطلاء رديئة، لوحة الخلايا في 1: مزيج 3 من N2 و B27 تستكمل وسائل الإعلام وتغيير هذا إلى N2B27 بعد اليومين الأولين. وسوف تبدأ الخلايا للتمييز ويجب أن تظهر التعبير Sox1 (مرئية من قبل مخضر لمراسل في خط الخلية 46C المستخدمة هنا) ضمن 4-6 أيام.

3. مناعي تلطيخ

لاTE: بروتوكول يمكن تطبيقها على أي نوع السفينة. يوصف حجم كل كاشف لكل بئر من لوحة 6 جيدا ويمكن زيادتها إلى أي مساحة السطح. لا ينصح Replating نظرا لقابلية منخفضة بعد ذلك.

إزالة التمايز المتوسطة وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 4٪ (ت / ت) لامتصاص العرق، وترك لمدة 15 دقيقة.
غسل وpermeabilize الخلايا مع 2 مل من PBS-T (الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.5٪ (V / V) توين-20) مرتين. يمكن أن تبقى الخلايا في برنامج تلفزيوني-T لمدة تصل إلى 2 أشهر في 4 ° C.
استبدال PBS-T مع 1 مل من برنامج تلفزيوني-T مع 10٪ (V / V) مصل (من نفس النوع كما الأجسام المضادة الثانوية). احتضان 1 ساعة على الكرسي الهزاز لوحة في RT لمنع أي غير محددة وملزمة.
بعد 1 ساعة، وغسل الخلايا مرتين مع 2 مل من PBS-T، واحتضان في 500 ميكرولتر الماوس مفتش ضد βIII تويولين (المخفف 1: 1000 في برنامج تلفزيوني-T مع 10٪ مصل). وضعت على لوحة الروك، وترك O / N عند 4 درجات مئوية.
من هذه الخطوة، دائما حماية السفينةبعيدا عن الضوء. غسل الخلايا مرتين مع PBS-T، ثم يضاف 500 ميكرولتر من المسمى مضان المضادة للماوس مفتش الأضداد (مخفف إلى 2 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-T مع 10٪ مصل). وضعه على لوحة الروك لمدة 1 ساعة على RT.
شطف الخلايا مرتين مع PBS-T، ثم يضاف 500 ميكرولتر من دابي (مخفف إلى 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-T) ويترك لمدة 5 دقائق.
غسل الخلايا مرة أخرى والاحتفاظ بها في برنامج تلفزيوني-T. الخلايا جاهزة لتصويرها، ويمكن أن تبقى لمدة تصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية. لاحظ أن يتلاشى إشارة GFP مع مرور الوقت لذلك فإنه من غير المناسب مقارنة كثافة GFP الخلايا الثابتة والحية أو الخلايا الثابتة في أوقات مختلفة.

النتائج

في هذه التجربة، استخدمنا خط خلية 46C ^14، الخلايا الجذعية الجنينية مع مراسل Sox1-GFP الذاتية، لتعقب التمايز العصبي. باستخدام هذا الخط الخلية، تعبيرا عن Sox1، وهي علامة للحصول على السلف العصبي، ويمكن الكشف عنها بواسطة مخضر. تصفيح كثافة يشكل عاملا حاسما لتحقيق تمايز الخل...

Discussion

كان بروتوكول التمايز العصبي أحادي الطبقة في استخدام لأكثر من عقد ^6. البروتوكول هو ذات كفاءة عالية، ويتألف من متوسطة محددة، وذلك في ظل نظام أحادي الطبقة مما يجعل النظام أكثر قابلية للتطبيق لما قبل السريرية (على سبيل المثال، فحص المخدرات) يستخدم. ومع ذلك، هنا...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01
B-27 Supplement, serum free	Life Technologies	17504-044
Insulin	Sigma	I6634	Reconstitute with sterile 0.01 M HCl
Apo-transferrin	Sigma	T1147	Reconstitute with sterile water
Progesterone	Sigma	P8783	Reconstitute with ethanol
Putrescine	Sigma	P5780	Reconstitute with sterile water
Sodium selenite	Sigma	S5261	Reconstitute with sterile water
Bovine albumin fraction V	Life Technologies	15260-037
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented
Gelatine	Sigma	G1890
6-well tissue culture dish	Thermo Scientific	140675
24-well tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
96-well tissue culture dish	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
MEM Non-essential amino acids solution	Life Technologies	11140-050
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
2-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Leukaemia inhibitory factor	prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20	Sigma	P1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma	D9542	Protect from light
Mouse anti βIII tubulin IgG antibody	Covance	MMS-435P
Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody	Life Technologies	A31571	Protect from light
25 cm² tissue culture flask	Thermo Scientific	156367

References

Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

99 N2B27

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: