Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

Resumo

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Resumo

A capacidade de diferenciação de células estaminais embrionárias de ratinho (ESC) para progenitores neurais permite o estudo dos mecanismos que controlam especificação neural, bem como a geração de tipos de células neuronais maduros para estudo posterior. Neste protocolo, descrevem um método para a diferenciação de ESC para progenitores neurais utilizando, cultura em monocamada sem soro. O método é escalável, eficiente e resulta num rendimento de ~ 70% de células progenitoras neurais dentro de 4-6 dias. Ele pode ser aplicado a partir de várias estirpes CES cultivadas sob uma variedade de condições. Progenitores neurais podem ser autorizados a diferenciar ainda mais em neurônios funcionais e glia ou analisados ​​por microscopia, técnicas de citometria de fluxo ou moleculares. O processo de diferenciação é passível de microscopia de lapso de tempo e pode ser combinada com o uso de linhas de repórter para monitorizar o processo de especificação neural. Nós fornecemos instruções detalhadas sobre a preparação de meios e optimização densidade celular para permitir que o processo abe aplicado a maioria das linhas de ESC e uma variedade de recipientes de cultura de célula.

Introdução

As células estaminais embrionárias são células pluripotentes derivadas do embrião com a capacidade de proliferar indefinidamente in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células dos adultos após reintrodução num embrião fase adequada (através da formação de uma quimera), injecção em hospedeiros singénicos ou imunocomprometidos (através da formação de um teratoma) ou in vitro sujeitos a estímulos apropriados ^1. A diferenciação in vitro de células estaminais embrionárias de ratinho em linhagens neurais foi descrita pela primeira vez em 1995 e envolveu a formação de agregados multicelulares suspensão (corpos embrióides, EBS) em meio contendo soro suplementado com o ácido retinóico morfogénio ^2-4. Uma vez que, em seguida, uma variedade de protocolos têm sido desenvolvidos para permitir a diferenciação neuronal ^5. Muitos ainda utilizar agregação, os outros co-cultura com indução de tipos de células e vários envolvem a utilização de meios isentos de soro. Todos os protocolos tem vantagens umand desvantagens e a natureza precisa da neural ou células neuronais produzida também varia de acordo com o protocolo utilizado.

O protocolo ideal seria robusta, escalável e fazer uso de meios totalmente definidos e substratos, ser passíveis de monitorização não invasiva do processo de diferenciação e resultar na geração de populações puras de células progenitoras neurais capazes de ser modelado por sinais externos e para diferenciar em todos os subtipos neuronais e gliais com elevada eficiência e rendimento em relativamente pouco tempo. Nos últimos doze anos, temos vindo a utilizar um método para gerar progenitores neurais e neurônios de rato ESC em uma baixa densidade, cultura monocamada aderente sem soro ^6-10. Este protocolo cumpre muitos dos critérios enunciados anteriormente: em nossas mãos a eficiência de diferenciação tem sido bastante consistente ao longo de muitos anos e uma variedade de linhas de células, ele pode ser escalado para cima ou para baixo (que usamos com sucesso navios de placas de 96 poços para 15 cm de diâmetro diela é) e os meios usados ​​são bem definidos. O processo é passível de microscopia Timelapse para o controlo da diferenciação e uma variedade de padrões de sinais pode ser adicionado para induzir a geração de tipos distintos de subtipos neuronais (por exemplo, a Shh e Fgf8 para neurónios dopaminérgicos ^6).

No entanto, existem alguns desafios para o sucesso da aplicação deste protocolo. Um dos aspectos fundamentais é uma preparação cuidadosa da mídia. Nós sempre preparar a mídia in-house, apesar da disponibilidade de alternativas comerciais. Um dos suplementos usados ​​(N2; ver Protocol) tem modificações sobre o padrão versões disponíveis no mercado. Finalmente, uma das etapas mais importantes para a aplicação bem sucedida deste método é a densidade celular óptima para o chapeamento. Isto é principalmente devido ao passo que a natureza autócrina de um dos sinais indutores (FGF4 ¹¹⁾ requer que as células estão presentes suficientes para permitir viabil óptimadade e diferenciação, em muito altas densidades diferenciação é prejudicada (possivelmente em parte devido à produção autócrina de LIF ^12). Portanto, é importante que a preparação ambos os meios e revestimento celular são realizadas com cuidado e de forma consistente para assegurar os melhores resultados.

Protocolo

1. Preparação de mídia

NOTA: O protocolo baseia-se na utilização de uma mistura de dois meios separados: DMEM / F12 suplementado com suplemento N2 modificado e Neurobasal suplementado com suplemento B27, tipicamente numa proporção de 1: 1.

1. Prepara-se o suplemento N2 modificado por mistura dos componentes num tubo de 15 ml. Não vórtice ou filtrar este; misturar por inversão do tubo até a solução ficar clara.
   1. Iniciar pipetando 7,2 ml de DMEM / F12, em seguida adicionar 1 ml de 25 mg / ml de insulina (fez-se em 0,01 M de HCl) e misturar bem por inversão do tubo. É preciso um par de minutos até que a solução é clara.
   2. Adicionar 1 ml de 100 mg / ml de apo-transferrina (preparados em água), 33 ul de 0,6 mg / ml progesternone (confeccionados a partir de etanol), 100 uL de 160 mg / ml (1 M) putrescina (preparados em água ), 10 ul de 3 mM de selenito de sódio (preparados em água) e 666 ul de 7,5% de albumina de soro bovino e misturar bem o tubo. Alíquota em 2,5 ml e armazenar a -20 °C por até 2 meses.
2. Prepare a mídia.
   1. Para 250 ml de meio DMEM / F12 adicionar 2,5 ml de N2. Misture bem, mas não agite ou filtro.
   2. Para 250 ml de Neurobasal meios adicionar 5 ml de suplemento de B27. Misture bem, mas não agite ou filtro.
   3. Misture a mídia da passos 1.2.1 e 1.2.2 em uma proporção de 1: 1. Em alguns casos, uma mistura 1: mistura 3 pode ser necessárias (suplementado como o 1: 1 mistura no passo 1.2.4).
   4. Para a mistura de adicionar 0,5 mL de L-glutamina (concentração final 0,2 mM) e 3,5 ul de 2-mercaptoetanol (concentração final 0,1 mM) e misturar bem, sem agitação. Armazene a mídia a 4 ° C por até 3 semanas e evitar a exposição à luz. Esta mistura final é chamada N2B27.
3. Preparar a solução de gelatina.
   1. Prepara-se uma solução de gelatina a 1% em água ultrapura e autoclave a 121 ° C, 15 psi, durante 15 min. É importante que o frasco utilizado para este está completamente limpa de detergentes ou os desinfectantes, então recomenda-se que uma nova garrafa éutilizado para isso e é sempre apenas lavado em água ultrapura entre utilizações. Alíquota da solução a 1% em 50 ml de partes alíquotas e manter a 4 ° C, durante meses.
   2. Aquece-se uma alíquota de 1% de gelatina em um banho de água a 37 C ° até se dissolver e adicionar a 500 ml de solução salina tamponada com fosfato quente (PBS). Misturar bem e pipetar suficiente para cobrir o fundo de cada poço ou placa. Permitir que a gelatina para revestir a superfície durante pelo menos 30 min.

2. plaqueamento das células

NOTA: Este protocolo se aplica igualmente a ESC rato cultivadas em 10% de soro com fator inibidor de leucemia (LIF), a substituição de soro com LIF ou meios livres de soro com proteína LIF e morfogenética óssea 4 (BMP4) ou inibidores de MEK e GSK3 (media 2i) com ou sem LIF. No entanto, o momento ea eficiência da diferenciação pode variar dependendo da mídia e células (ver discussão). Para os experimentos mostrados aqui usamos a linha 46C rato ESC (que tem um repórter EGFP batido om dos alelos Sox1 endógenos), cultivadas em GMEM com 10% de soro e LIF. Para melhores resultados, é importante que as células são dissociadas e replated na mídia N2B27; simplesmente mudando de mídia a partir de GMEM / soro / LIF para N2B27 sempre resulta em uma redução da eficiência de diferenciação em relação ao repique das células.

1. Cresça as células em GMEM com 10% de soro, 1 mM de piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais 1x, 0,1 M de 2-mercaptoetanol, e 100 unidades / ml de LIF ^13. Para obter uma cultura subconfluentes de rato ESC, placa 1 x 10 ⁶ células em uma cultura frasco T25, que terá 2-3 dias.
2. Observar células sob microscópio de campo brilhante. Quando as células são subconfluentes e pronto para passagem, lave-os duas vezes em PBS. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação de células e retornar para o incubador durante 2-5 min. Embora tripsina e outras enzimas podem também ser usados ​​para dissociação de células, podem ter um impacto negativo sobre a ligação de células de modo que as densidades de plaqueamento terá de ser ajustÃsted.
3. Uma vez que as células começam a levantar a partir da placa, toque no vaso para desalojar-los em uma suspensão de células individuais. Recolher as células para um total de 10 ml de meio de dissociação de células e reagente e pipeta para um tubo de centrífuga de 15 ml.
4. Rodar as células a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente.
5. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de N2B27 pré-aquecido por pipetagem para cima e para baixo 3-5 vezes. Quando pipetando a suspensão para baixo, da pipeta contra o lado do tubo para evitar a criação de bolhas. Contar as células com um contador de células automatizado ou um hemocitómetro e registar a concentração.
6. Prepara-se uma suspensão de células contendo o número desejado de células por unidade de volume a ser plaqueadas por cavidade em N2B27 pré-aquecido. Uma densidade de 10.500 células por cm ² de um prato de 6 poços (isto é, 1 x 10 ⁵ células por poço de um prato de 6 poços) é o ideal. Ver Tabela 1 para o número de células sugerido por cm ² e PLAting volumes de suporte para uma variedade de recipientes de cultura de célula.
7. Aspirar a gelatina a partir do vaso de cultura e placa a suspensão de células de acordo com a densidade e volume de sugerido na Tabela 1. Não rodar as placas de que este vai concentrar-se as células para o centro. Coloque as culturas numa incubadora húmida a 37 ° C, 5% de CO _2.
8. Mudança de mídia a cada 1-2 dias, a substituição de todos os meios de comunicação com N2B27 fresco. Pipeta suavemente como a lavagem das células pode afetar a densidade e diminuir a eficiência de diferenciação nos dias seguintes. Onde viabilidade inicial após o plaqueamento é pobre, placa as células em uma 1: 3 mistura dos meios de comunicação N2 e B27-suplementados e mudar isso para N2B27 após os dois primeiros dias. As células começam a diferenciar e deve mostrar expressão Sox1 (visível por fluorescência verde do repórter na linha celular utilizada aqui 46C) dentro de 4-6 dias.

3. Immunofluorescent Coloração

NÃOTE: O protocolo pode ser aplicado a qualquer tipo de navio. O volume de cada reagente é descrito por poço da placa de 6 poços e pode ser dimensionada para qualquer área de superfície. Repique não é recomendada devido à viabilidade baixa depois.

1. Remover meio de diferenciação e fixar as células por adição de 500 ul de 4% (v / v) de paraformaldeído, deixar durante 15 min.
2. Lavar e permeabilizar as células com 2 ml de PBS-T (solução salina tamponada com fosfato com 0,5% (v / v) de Tween-20) por duas vezes. As células podem ser mantidas em PBS-T, durante até 2 meses a 4 ° C.
3. Substituir PBS-T com 1 ml de PBS-T com 10% (v / v) de soro (a partir da mesma espécie que o anticorpo secundário). Incubar 1 hora sobre o roqueiro placa à temperatura ambiente para bloquear qualquer ligação não específica.
4. Após 1 h, lavar as células duas vezes com 2 ml de PBS-T, e incuba-se 500 ul de IgG de ratinho contra βIII-tubulina (diluída 1: 1000 em PBS-T, com 10% de soro). Colocar no prato oscilante, e deixar O / N a 4 ° C.
5. A partir deste passo, sempre proteger o vasoda luz. Lavar as células duas vezes com PBS-T, em seguida, adicionar 500 ul de anticorpo anti-IgG de ratinho marcado com fluorescência (diluída a 2 ug / ml em PBS-T, com 10% de soro). Colocá-lo sobre a placa oscilante durante 1 h à TA.
6. Lavar as células duas vezes com PBS-T, em seguida, adicionar 500 mL de DAPI (diluído para 0,5 ug / ml em PBS-T) e deixar durante 5 min.
7. Lavam-se as células novamente e mantê-las em PBS-T. As células estão prontas para ser fotografado e pode ser mantido por até 2 semanas a 4 ° C. Note que o sinal GFP desaparece ao longo do tempo, por isso é inadequado para comparar a intensidade GFP de células fixas e ao vivo ou de células fixadas em momentos diferentes.

Resultados

Nesta experiência, utilizou-se a linha de células de ¹⁴ 46C, células estaminais embrionárias de ratinho com um endógeno Sox1-repórter GFP, para controlar a diferenciação neuronal. Utilizando esta linha celular, expressão de Sox1, um marcador para células progenitoras neurais, pode ser detectado por fluorescência verde. Chapeamento de densidade é um fator crítico para alcançar a diferenciação neuronal. Células estaminais embrionárias de ratinho foram plaqueadas em placas de 6 poços em difere...

Discussão

O protocolo de diferenciação neural monocamada tem sido usado por mais de uma década ^6. O protocolo é altamente eficiente, composto de meio definido, e feito de um sistema de monocamada que torna o sistema mais aplicável para pré-clínica (por exemplo, o rastreio de fármacos) usa. No entanto, existem alguns factores críticos que determinam a eficiência de diferenciação. Este artigo aponta esses fatores ea solução para cada obstáculo.

Densidade das células a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01
B-27 Supplement, serum free	Life Technologies	17504-044
Insulin	Sigma	I6634	Reconstitute with sterile 0.01 M HCl
Apo-transferrin	Sigma	T1147	Reconstitute with sterile water
Progesterone	Sigma	P8783	Reconstitute with ethanol
Putrescine	Sigma	P5780	Reconstitute with sterile water
Sodium selenite	Sigma	S5261	Reconstitute with sterile water
Bovine albumin fraction V	Life Technologies	15260-037
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented
Gelatine	Sigma	G1890
6-well tissue culture dish	Thermo Scientific	140675
24-well tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
96-well tissue culture dish	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
MEM Non-essential amino acids solution	Life Technologies	11140-050
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
2-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Leukaemia inhibitory factor	prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20	Sigma	P1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma	D9542	Protect from light
Mouse anti βIII tubulin IgG antibody	Covance	MMS-435P
Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody	Life Technologies	A31571	Protect from light
25 cm2 tissue culture flask	Thermo Scientific	156367