Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

Riepilogo

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Abstract

La capacità di differenziare le cellule staminali embrionali di topo (ESC) per progenitori neurali consente lo studio dei meccanismi di controllo specifica neurali nonché la generazione di tipi di cellule neuronali mature per ulteriori studi. In questo protocollo si descrive un metodo per la differenziazione di ESC per progenitori neurali usano senza siero, cultura monostrato. Il metodo è scalabile, efficiente e si traduce in produzione di circa il 70% di cellule progenitrici neurali entro 4-6 giorni. Esso può essere applicato a ESC da vari ceppi coltivate sotto una varietà di condizioni. Progenitori neurali possono essere autorizzati a differenziare ulteriormente in neuroni funzionali e glia o analizzati al microscopio, il flusso delle tecniche di citometria o molecolari. Il processo di differenziazione è suscettibile di microscopia time-lapse e può essere combinato con l'uso di linee giornalista per monitorare il processo di specifica neurale. Noi forniamo istruzioni dettagliate sulla preparazione dei media e l'ottimizzazione della densità cellulare per consentire il processo di Be applicato alla maggior parte delle linee ESC e una varietà di recipienti di coltura cellulare.

Introduzione

Le cellule staminali embrionali sono cellule pluripotenti derivate da embrione precoce con la capacità di proliferare indefinitamente in vitro, pur mantenendo la capacità di differenziarsi in tutti i tipi cellulari adulti seguenti reintroduzione in un apposito embrione stadio (formando una chimera), iniezione in singenici o immunocompromessi host (formando un teratoma) o in vitro soggetto a segnali appropriati ^1. La differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali è stato descritto nel 1995 e prevedeva la formazione di aggregati multicellulari di sospensione (corpi embrionali, EBS) in mezzi di siero contenenti integrati con l'acido retinoico morfogeno ^2-4. Da allora una serie di protocolli sono stati sviluppati per permettere la differenziazione neuronale ^5. Molti ancora utilizzare l'aggregazione, gli altri co-coltura con induzione tipi di cellule e molti prevedono l'utilizzo di mezzi privi di siero. Tutti i protocolli hanno vantaggi and svantaggi e la natura precisa neurali o cellule neuronali prodotte anche varia secondo il protocollo usato.

Il protocollo ideale sarebbe robusto, scalabile e fare uso di mezzi di comunicazione e substrati completamente definiti, essere suscettibili di monitoraggio non invasivo del processo di differenziazione e causare la generazione delle popolazioni pure di cellule progenitrici neurali in grado di essere modellato da stimoli esterni e per differenziare in tutti i sottotipi neuronali e gliali con elevata efficienza e la resa in un tempo relativamente breve. Negli ultimi dodici anni abbiamo utilizzato un metodo per la generazione di progenitori neurali e neuroni di topo CES in una bassa densità, privo di siero cultura monostrato aderente ^6-10. Questo protocollo soddisfa molti dei criteri di cui sopra: nelle nostre mani l'efficienza della differenziazione è stato abbastanza costante nel corso di molti anni, e una varietà di linee cellulari, si può essere scalato verso l'alto o verso il basso (usiamo con successo navi di piastre da 96 pozzetti per 15 centimetri di diametro dishes) ei supporti utilizzati sono ben definiti. Il processo è suscettibile di microscopia timelapse per il monitoraggio della differenziazione e una varietà di segnali patterning può essere aggiunto per indurre la generazione di tipi distinti di sottotipi neuronali (es Shh e Fgf8 per i neuroni dopaminergici ^6).

Tuttavia, ci sono alcune sfide per l'efficace applicazione di questo protocollo. Uno degli aspetti chiave è un'attenta preparazione dei media. Abbiamo sempre prepariamo il supporto in-house nonostante la disponibilità di alternative commerciali. Uno degli integratori utilizzati (N2; vedi Protocol) ha modifiche nel corso dello standard versioni disponibili in commercio. Infine, una delle fasi più importanti per il successo di questo metodo è la densità cellulare ottimale placcatura. Questo è principalmente perché mentre la natura autocrina di uno dei segnali che inducono (Fgf4 ¹¹⁾ richiede che le cellule sono presenti sufficienti per consentire viabil ottimalelità e la differenziazione, a troppo elevate densità di differenziazione è compromessa (forse in parte a causa della produzione autocrina di LIF ^12). È quindi importante che la preparazione sia supporti e placcatura cellule vengono eseguite accuratamente e costantemente per garantire risultati ottimali.

Protocollo

1. Carta Preparazione

NOTA: Il protocollo si basa sull'utilizzo di una miscela di due distinti mezzi: DMEM / F12 addizionato con modificato supplemento N2 e Neurobasal supplementato con supplemento B27, tipicamente in un rapporto 1: 1.

1. Preparare il supplemento N2 modificato mescolando i componenti in una provetta da 15 ml. Non vortice o filtrare questo; mescolare capovolgendo la provetta fino a quando la soluzione è limpida.
   1. Inizia pipettando 7,2 ml di DMEM / F12, quindi aggiungere 1 ml di 25 mg / ml di insulina (composta in 0,01 M HCl) e mescolare bene invertendo il tubo. Ci vogliono un paio di minuti fino a quando la soluzione è limpida.
   2. Aggiungere 1 ml di 100 mg / ml apo-transferrina (preparati in acqua), 33 ml di 0,6 mg / ml progesternone (costituiti in etanolo), 100 ml di 160 mg / ml (1 M) putrescina (preparati in acqua ), 10 ml di 3 mM selenito di sodio (preparati in acqua) e 666 ml di 7,5% di siero albumina bovina e mescolare bene il tubo. Aliquota in 2,5 ml e conservare a -20 °C per un massimo di 2 mesi.
2. Preparare il supporto.
   1. Per 250 ml di DMEM / F12 aggiungere 2,5 ml di N2. Mescolare bene ma non scuotere o filtro.
   2. Per 250 ml di Neurobasal media aggiungi 5 ml di supplemento B27. Mescolare bene ma non scuotere o filtro.
   3. Mescolare il supporto da operazioni 1.2.1 e 1.2.2 in un rapporto 1: 1. In alcuni casi un 1: 3 mix può essere richiesto (integrato come il 1: 1 mix al punto 1.2.4).
   4. Per il mix di aggiungere 0,5 ml di L-glutammina (concentrazione finale 0,2 mm) e 3,5 ml di 2-mercaptoetanolo (concentrazione finale 0,1 mm) e mescolare bene senza agitare. Conservare il supporto a 4 ° C per un massimo di 3 settimane e non esporre alla luce. Questo mix finale si chiama N2B27.
3. Preparare la soluzione di gelatina.
   1. Preparare una soluzione di gelatina 1% in acqua ultrapura e autoclave a 121 ° C, 15 psi, per 15 min. È importante che la bottiglia utilizzata per questo è completamente pulito da detergenti o disinfettanti, quindi si raccomanda una nuova bottiglia èutilizzato per questo ed è sempre risciacquato solo in acqua ultrapura tra usi. Aliquota della soluzione all'1% in 50 ml aliquote e conservare a 4 ° C per mesi.
   2. Scaldare un'aliquota di 1% di gelatina in un bagno d'acqua a 37 ° fino a scioglimento e aggiungere 500 ml di soluzione salina tamponata con fosfato calda (PBS). Mescolare bene e pipettare sufficiente a coprire il fondo di ogni bene o un piatto. Lasciare la gelatina per rivestire la superficie per almeno 30 min.

2. placcatura celle

NOTA: Questo protocollo vale anche per il mouse ESC coltivato in 10% di siero di leucemia fattore inibitorio (LIF), la sostituzione di siero con LIF o supporti privi di siero con LIF e proteina morfogenetica dell'osso 4 (BMP4) o MEK e GSK3 inibitori (supporti 2i) con o senza LIF. Tuttavia, i tempi e l'efficienza della differenziazione possono variare a seconda del supporto e le cellule (vedi la discussione). Per gli esperimenti riportati qui abbiamo usato la linea 46C del mouse ESC (che ha un reporter EGFP buttato in one degli alleli Sox1 endogeni), coltivati ​​in GMEM con 10% siero e LIF. Per ottenere risultati ottimali, è importante che le cellule sono dissociate e ripiastrate nei media N2B27; semplicemente cambiando di supporti da GMEM / siero / LIF a N2B27 si traduce sempre in efficienza differenziazione ridotto rispetto replating cellule.

1. Far crescere le cellule in GMEM con 10% di siero, 1 mM piruvato di sodio, aminoacidi non essenziali 1x, 0,1 M 2-mercaptoetanolo, e LIF ¹³ 100 unità / ml. Per avere una cultura subconfluenti di topo ESC, piatto 1 x 10 ⁶ cellule in un pallone di coltura T25 che avrà 2-3 giorni.
2. Osservare le cellule al microscopio in campo chiaro. Quando le cellule sono subconfluenti e pronti per il passaggio, sciacquare due volte in PBS. Aggiungere 1 ml di cellule dissociazione reagenti e ritorno per l'incubatore per 2 - 5 min. Sebbene tripsina e di altri enzimi possono essere utilizzati anche per la dissociazione cellulare, possono avere un impatto negativo sulla adesione cellulare così le densità di placcatura dovranno essere regosted.
3. Una volta che le cellule iniziano a sollevare dalla piastra, toccare il vaso loro rimuovere in una sospensione di cellule singole. Raccogliere le cellule in un totale di 10 ml di mezzi di comunicazione e di dissociazione delle cellule del reagente e pipetta in una provetta da centrifuga da 15 ml.
4. Spin le cellule a 300 xg per 3 minuti a temperatura ambiente.
5. Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di N2B27 preriscaldata pipettando su e giù 3 - 5 volte. Quando pipettando sospensione giù, pipetta contro il lato del tubo per evitare la creazione di bolle. Contare le cellule con un contatore di cellule automatico o un emocitometro e registrare la concentrazione.
6. Preparare una sospensione cellulare contenente il numero desiderato di cellule per unità di volume da placcare per pozzetto in N2B27 pre-riscaldato. Una densità di 10.500 cellule per cm ² in un piatto da 6 pozzetti (cioè, 1 x 10 ⁵ cellule per pozzetto di un piatto 6 pozzetti) è ottimale. Vedi Tabella 1 per il numero consigliato di cellule per cm ² e plating volumi di media per una serie di recipienti di coltura cellulare.
7. Aspirare la gelatina dal recipiente di coltura e la piastra della sospensione cellulare in funzione della densità suggerito e volume in Tabella 1. Non agitare le piastre in quanto ciò concentrare le cellule al centro. Collocare le culture in un incubatore umido a 37 ° C, 5% CO _2.
8. Modificare i media ogni 1 - 2 giorni, sostituendo tutti i media con N2B27 fresca. Pipetta delicatamente come vampate di calore le cellule potrebbero incidere densità e diminuire l'efficienza differenziazione nei giorni successivi. Dove vitalità iniziale dopo la placcatura è povero, piastra le cellule in un 1: 3 mix dei media N2 e B27-integrati e cambiare questo N2B27 dopo i primi due giorni. Le cellule cominceranno a differenziare e dovrebbero mostrare espressione Sox1 (visibile fluorescenza verde del reporter nella linea cellulare 46C usato qui) entro 4 - 6 giorni.

3. immunofluorescenza

NOTE: Il protocollo può essere applicato a qualsiasi tipo di imbarcazione. Il volume di ogni reagente è descritta per pozzetto di 6 pozzetti e può essere installato su qualsiasi superficie. Replating è sconsigliato a causa della bassa redditività in seguito.

1. Rimuovere terreno di differenziamento e fissare le cellule aggiungendo 500 ml di 4% (v / v) paraformaldeide, lasciare per 15 min.
2. Lavare e permeabilize le cellule con 2 ml di PBS-T (tampone fosfato salino con 0,5% (v / v) di Tween-20) due volte. Le cellule possono essere mantenute in PBS-T fino a 2 mesi a 4 ° C.
3. Sostituire PBS-T con 1 ml di PBS-T con 10% (v / v) di siero (dalla stessa specie come anticorpo secondario). Incubare 1 ora sulla sedia a dondolo piatto a temperatura ambiente per bloccare qualsiasi legame non specifico.
4. Dopo 1 ora, lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS-T, e incubare in 500 microlitri IgG topo contro βIII-tubulina (diluito 1: 1000 in PBS-T con siero 10%). Mettere sul rocker piatto, e lasciare O / N a 4 ° C.
5. Da questo punto, proteggere sempre il recipientedalla luce. Lavare le cellule due volte con PBS-T, quindi aggiungere 500 ml di fluorescenza marcato anti-topo IgG (diluito a 2 mg / ml in PBS-T con siero 10%). Mettilo sul bilanciere piatto per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Lavare le cellule due volte con PBS-T, quindi aggiungere 500 ml di DAPI (diluito a 0,5 mg / ml in PBS-T) e lasciar riposare per 5 minuti.
7. Lavare nuovamente le cellule e tenerli in PBS-T. Le cellule sono pronte per essere fotografata e possono essere conservati per un massimo di 2 settimane a 4 ° C. Si noti che il segnale GFP svanisce nel tempo in modo non è opportuno confrontare l'intensità GFP delle cellule fisse e in diretta o di cellule fissate in tempi diversi.

Risultati

In questo esperimento, abbiamo utilizzato la linea cellulare 46C ^14, le cellule staminali embrionali di topo con un endogena Sox1-reporter GFP, per monitorare la differenziazione neuronale. Utilizzando questa linea cellulare, espressione di Sox1, un marker per progenitore neuronale, può essere rilevata da fluorescenza verde. Placcatura densità è un fattore critico per raggiungere la differenziazione neuronale. Cellule staminali embrionali di topo sono stati placcati in 6 pozzetti a diverse densità che var...

Discussione

Il protocollo di differenziamento neurale monostrato è stato in uso per oltre un decennio ^6. Il protocollo è altamente efficiente, composto terreno specifico, e fatto in un sistema monostrato che rende il sistema più applicabile per preclinica (ad esempio, la selezione della droga) utilizza. Tuttavia, vi sono alcuni fattori critici che determinano l'efficienza differenziazione. Questo articolo sottolinea questi fattori e la soluzione per ogni ostacolo.

Densità del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01
B-27 Supplement, serum free	Life Technologies	17504-044
Insulin	Sigma	I6634	Reconstitute with sterile 0.01 M HCl
Apo-transferrin	Sigma	T1147	Reconstitute with sterile water
Progesterone	Sigma	P8783	Reconstitute with ethanol
Putrescine	Sigma	P5780	Reconstitute with sterile water
Sodium selenite	Sigma	S5261	Reconstitute with sterile water
Bovine albumin fraction V	Life Technologies	15260-037
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented
Gelatine	Sigma	G1890
6-well tissue culture dish	Thermo Scientific	140675
24-well tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
96-well tissue culture dish	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
MEM Non-essential amino acids solution	Life Technologies	11140-050
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
2-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Leukaemia inhibitory factor	prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20	Sigma	P1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma	D9542	Protect from light
Mouse anti βIII tubulin IgG antibody	Covance	MMS-435P
Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody	Life Technologies	A31571	Protect from light
25 cm2 tissue culture flask	Thermo Scientific	156367