Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

Résumé

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Résumé

La capacité à différencier les cellules souches embryonnaires de souris (ESC) pour progéniteurs neuronaux, permet l'étude des mécanismes de contrôle de la spécification de neurones ainsi que la génération de types de cellules neurales matures pour complément d'étude. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé pour la différenciation de cellules progénitrices neurales ESC à l'aide de la culture en monocouche sans sérum. Le procédé est évolutive, efficace et aboutit à la production de ~ 70% de cellules progénitrices neurales à l'intérieur de 4-6 jours. Il peut être appliqué à l'ESC de diverses souches cultivées dans une variété de conditions. Progéniteurs neuronaux peuvent être autorisés à différencier en neurones fonctionnels et cellules gliales ou analysés par microscopie, cytométrie en flux ou moléculaires techniques. Le processus de différenciation est prête à la microscopie time-lapse et peut être combiné avec l'utilisation de lignes de rapporteurs pour surveiller le processus de spécification de neurones. Nous fournissons des instructions détaillées sur la préparation des milieux et de l'optimisation de la densité des cellules pour permettre au processus à be appliquée à la plupart des lignées de CSE et une variété de récipients de culture cellulaire.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires sont des cellules pluripotentes dérivées de l'embryon précoce ayant la capacité de proliférer indéfiniment in vitro, tout en conservant la capacité de se différencier en tous les types cellulaires adulte suivantes réintroduction dans un embryon au stade approprié (par formation d'une chimère), l'injection dans syngéniques ou immunodéprimés hôtes (en formant un tératome) ou in vitro soumis à des indices appropriés ^1. La différenciation in vitro de souris des cellules souches embryonnaires dans des lignées neurales a été décrite la première fois en 1995 et a impliqué la formation d'agrégats multicellulaires de suspension (corps embryoïdes, EB) dans des milieux contenant du sérum supplémenté avec de l'acide rétinoïque morphogène ^2-4. Depuis lors, un grand nombre de protocoles ont été développés pour permettre la différenciation de neurones ^5. Beaucoup utilisent encore l'agrégation, d'autres co-culture avec induisant types de cellules et plusieurs impliquent l'utilisation de milieux sans sérum. Tous les protocoles ont des avantages d'une inconvénients et la nature précise des neurones ou des cellules neuronales produites varie également selon le protocole utilisé.

Le protocole idéal serait robuste, évolutive et faire usage des médias et des substrats entièrement définis, se prêter à la surveillance non invasive du processus de différenciation et entraîner la génération de populations pures de progéniteurs neuronaux pouvant être modelée par des indices externes et de différencier dans tous les sous-types neuronales et gliales avec une grande efficacité et le rendement dans un temps relativement court. Dans les douze dernières années, nous avons utilisé une méthode pour générer des progéniteurs neuronaux et les neurones de souris ESC dans une faible densité, la culture de monocouche adhérente sans sérum ^6-10. Ce protocole répond à la plupart des critères énoncés ci-dessus: dans nos mains l'efficacité de la différenciation a été assez constante au cours de nombreuses années et une variété de lignées cellulaires, il peut être agrandie ou réduite (nous utilisons avec succès les navires des plaques à 96 puits à 15 cm de diamètre dishes) et les supports utilisés sont bien définis. Le procédé se prête à la microscopie Timelapse pour le contrôle de la différenciation et une variété de structuration indices peuvent être ajoutés pour induire la production de différents types de sous-types de neurones (par exemple, Shh et Fgf8 pour les neurones dopaminergiques ^6).

Néanmoins, il ya des défis à l'application réussie de ce protocole. Un des aspects clés est une préparation minutieuse des médias. Nous préparons toujours les médias en interne malgré la disponibilité d'alternatives commerciales. Un des suppléments utilisés (N2; voir le protocole) a plus de modifications à la norme de versions disponibles dans le commerce. Enfin, l'une des étapes les plus importantes pour l'application réussie de cette méthode est la densité cellulaire optimale au placage. Ceci est principalement parce que tandis que la nature autocrine de l'un des signaux induisant (FGF4 ¹¹⁾ exige que suffisamment de cellules sont présents pour permettre VIABIL optimalelité et la différenciation, à la différenciation trop élevées des densités de dépréciation (éventuellement en partie due à la production autocrine de FRV ^12). Il est donc important que la préparation des deux médias et le placage de cellules sont réalisées avec soin et de manière cohérente afin de garantir des résultats optimaux.

Protocole

1. Préparation des médias

NOTE: Le protocole repose sur l'utilisation d'un mélange de deux supports séparés: DMEM / F12 additionné de supplément N2 modifié et Neurobasal additionné de supplément B27, typiquement dans un rapport de 1: 1.

1. Préparer le supplément N2 modifié en mélangeant les composants dans un tube de 15 ml. Ne pas vortex ou filtrer cette; mélanger en inversant le tube jusqu'à ce que la solution est claire.
   1. Commencez par pipetage 7,2 ml de DMEM / F12, puis ajouter 1 ml de 25 mg / ml d'insuline (constitué dans HCl 0,01 M) et bien mélanger en inversant le tube. Il prend quelques minutes jusqu'à ce que la solution est claire.
   2. Ajouter 1 ml de 100 mg / ml apo-transferrine (préparés dans l'eau), 33 pi de 0,6 mg / ml progesternone (faites dans de l'éthanol), 100 pi de 160 mg / ml (1 M) putrescine (composé dans l'eau ), 10 pl de sélénite 3 mM de sodium (préparés dans l'eau) et 666 ul de 7,5% d'albumine de sérum bovin et bien mélanger le tube. Aliquote dans 2,5 ml et conserver à -20 °C pendant jusqu'à 2 mois.
2. Préparer les médias.
   1. Pour 250 ml de DMEM / F12 ajouter 2,5 ml de N2. Mélangez bien, mais ne pas secouer ou le filtre.
   2. Pour 250 ml de Neurobasal médias ajouter 5 ml de supplément de B27. Mélangez bien, mais ne pas secouer ou le filtre.
   3. Mélanger les médias à partir des étapes 1.2.1 et 1.2.2 dans un rapport de 1: 1. Dans certains cas, un 1: mélange 3 peut être nécessaire (complétée le mélange 1: 1 à l'étape 1.2.4).
   4. Pour le mélange ajouter 0,5 ml de L-glutamine (concentration finale 0,2 mM) et 3,5 pi de 2-mercaptoéthanol (concentration finale 0,1 mM) et bien mélanger sans agitation. Entreposer le support à 4 ° C pendant jusqu'à trois semaines et ne pas exposer à la lumière. Ce mélange final est appelé N2B27.
3. Préparer la solution de gélatine.
   1. Préparer une solution de gélatine à 1% dans de l'eau ultrapure et autoclave à 121 ° C, 15 psi, pendant 15 minutes. Il est important que la bouteille utilisée pour cela est complètement propre des détergents ou des désinfectants, il est donc recommandé qu'une nouvelle bouteille estutilisé pour cela et est seulement jamais rincé à l'eau ultra pure entre les utilisations. Aliquoter la solution à 1% en portions de 50 ml et de garder à 4 ° C pendant des mois.
   2. Chauffer une partie aliquote de 1% de gélatine dans un bain d'eau à 37 ° jusqu'à dissolution et ajouter à 500 ml de solution saline tiède tamponnée au phosphate (PBS). Mélangez bien et pipette assez pour couvrir le fond de chaque puits ou d'une plaque. Autoriser la gélatine pour enrober la surface pendant au moins 30 min.

2. Placage des cellules

NOTE: Ce protocole vaut également pour ESC de souris cultivées dans 10% de sérum avec le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), le remplacement de sérum avec un FRV ou un milieu sans sérum avec LIF et la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) ou inhibiteurs de MEK et GSK3 (médias 2i) avec ou sans FRV. Toutefois, le moment et l'efficacité de la différenciation peuvent varier selon les médias et les cellules (voir la discussion). Pour les expériences présentées ici nous avons utilisé la ligne 46C souris ESC (qui a un rapporteur de l'EGFP a frappé en on des allèles SOX1 endogènes), cultivés dans du GMEM avec 10% de sérum et LIF. Pour des résultats optimaux, il est important que les cellules sont dissociées et replaquées dans le milieu N2B27; changeant simplement de médias de GMEM / sérum / FRV à N2B27 aboutit toujours à une efficacité réduite par rapport à la différenciation les plaquant les cellules.

1. Cultiver les cellules dans GMEM avec 10% de sérum, du pyruvate de sodium 1 mM, acides aminés non essentiels 1x, 0,1 M de 2-mercaptoéthanol, et 100 unités / ml de LIF ^13. Pour obtenir une culture subconfluente de souris ESC, plaque 1 x 10 ⁶ cellules dans un flacon de culture T25 qui aura 2 - 3 jours.
2. Respecter les cellules sous champ lumineux microscope. Lorsque les cellules sont sous-confluente et prêt à passage, rincer deux fois dans du PBS. Ajouter 1 ml de cellules réactif de dissociation et revenir à l'incubateur pendant 2 - 5 min. Bien que la trypsine et d'autres enzymes peuvent également être utilisés pour la dissociation des cellules, elles peuvent avoir un impact négatif sur la fixation des cellules de sorte que les densités de placage devront être ADJUsted.
3. Une fois que les cellules commencent à soulever de la plaque, appuyez sur le navire pour les déloger dans une suspension cellulaire unique. Recueillir les cellules dans un total de 10 ml de médias et de dissociation cellulaire réactif et de la pipette dans un tube de 15 ml centrifugeuse.
4. Faites tourner les cellules à 300 g pendant 3 min à température ambiante.
5. Aspirer délicatement le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de pré-chauffé N2B27 par aspiration et refoulement 3 - 5 fois. Lorsque la suspension pipetage vers le bas, contre le bord pipette du tube pour éviter de créer des bulles. Compter les cellules avec un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre et enregistrer la concentration.
6. Préparer une suspension de cellules contenant le nombre désiré de cellules par unité de volume à être plaqué par puits dans préchauffé N2B27. Une densité de 10 500 cellules par cm ² dans un plat à 6 puits (par exemple, 1 x 10 ⁵ cellules par puits d'un plat à 6 puits) est optimale. Voir le tableau 1 pour suggéré nombre de cellules par cm ² et plaTing volumes de médias pour une variété de récipients de culture cellulaire.
7. Aspirer la gélatine à partir de la cuve de culture et de la plaque de la suspension cellulaire en fonction de la densité et le volume suggéré dans le Tableau 1. Ne pas agiter les plaques comme cela va concentrer les cellules vers le centre. Placez les cultures dans un incubateur humide à 37 ° C, 5% CO _2.
8. Changer de support tous les 1 - 2 jours en remplaçant tous les médias avec N2B27 frais. Pipette doucement rinçage des cellules pourrait affecter la densité et de réduire l'efficacité de la différenciation dans les jours suivants. Où viabilité initiale après l'étalement est pauvre, plaque les cellules dans un 1: 3 mélange des médias N2 et B27-complétées et changer cette N2B27 après les deux premiers jours. Les cellules commencent à se différencier et doivent montrer l'expression de Sox1 (visible par fluorescence verte de la journaliste dans la lignée cellulaire 46C utilisé ici) dans les 4 - 6 jours.

3. Coloration immunofluorescente

NONTE: Le protocole peut être appliqué à n'importe quel type de navire. Le volume de chaque réactif est décrite par puits de plaque de 6 puits et peut être adapté à toute surface. Réensemencement est pas recommandé en raison de la faible viabilité après.

1. Retirer le milieu de différenciation et de fixer les cellules par addition de 500 ul de 4% (v / v) de paraformaldehyde, laisser pendant 15 minutes.
2. Laver et perméabiliser les cellules avec 2 ml de PBS-T (solution saline tamponnée au phosphate avec 0,5% (v / v) de Tween-20) à deux reprises. Les cellules peuvent être maintenues dans du PBS-T pendant jusqu'à 2 mois à 4 ° C.
3. Remplacer PBS-T avec 1 ml de PBS-T contenant 10% (v / v) de sérum (de la même espèce que l'anticorps secondaire). Incuber 1 h sur la bascule de la plaque à la température ambiante pour bloquer toute liaison non spécifique.
4. Après 1 h, laver les cellules deux fois avec 2 ml de PBS-T, et incuber dans 500 ul d'IgG de souris contre ßlll-tubuline (dilué à 1: 1000 dans du PBS-T avec 10% de sérum). Mettez sur la bascule de la plaque et laisser O / N à 4 ° C.
5. De cette étape, toujours protéger le navirede la lumière. Laver les cellules deux fois avec du PBS-T, puis ajouter 500 ul d'anticorps IgG anti-souris marqué par fluorescence (dilué à 2 pg / ml dans du PBS-T avec 10% de sérum). Mettez-le sur la bascule de la plaque pendant 1 heure à température ambiante.
6. Rincer les cellules deux fois avec du PBS-T, puis ajouter 500 ul de DAPI (dilué à 0,5 ug / ml dans du PBS-T) et laisser reposer pendant 5 min.
7. Laver les cellules à nouveau et les garder dans PBS-T. Les cellules sont prêts à être photographiés et peuvent être conservés pendant un maximum de 2 semaines à 4 ° C. Notez que le signal de la GFP disparaît au fil du temps il est donc inapproprié de comparer l'intensité de la GFP de cellules fixes et vivants ou des cellules fixées à des moments différents.

Résultats

Dans cette expérience, nous avons utilisé la lignée cellulaire 46C ^14, les cellules souches embryonnaires de souris avec une endogène Sox1-GFP journaliste, pour suivre la différenciation neuronale. En utilisant cette lignée cellulaire, l'expression de Sox1, un marqueur pour les progéniteurs neuronaux, peut être détectée par la fluorescence verte. Placage densité est un facteur critique pour atteindre la différenciation neuronale. Souris des cellules souches embryonnaires ont été étalées da...

Discussion

Le protocole de différenciation neurale monocouche a été en usage depuis plus d'une décennie ^6. Le protocole est très efficace, composée d'un milieu défini, et fait dans un système de monocouche qui rend le système plus applicable pour préclinique (par exemple, le criblage de médicaments) utilise. Toutefois, il existe certains facteurs critiques qui déterminent l'efficacité de différenciation. Cet article souligne les facteurs et la solution pour chaque obstacle.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01
B-27 Supplement, serum free	Life Technologies	17504-044
Insulin	Sigma	I6634	Reconstitute with sterile 0.01 M HCl
Apo-transferrin	Sigma	T1147	Reconstitute with sterile water
Progesterone	Sigma	P8783	Reconstitute with ethanol
Putrescine	Sigma	P5780	Reconstitute with sterile water
Sodium selenite	Sigma	S5261	Reconstitute with sterile water
Bovine albumin fraction V	Life Technologies	15260-037
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented
Gelatine	Sigma	G1890
6-well tissue culture dish	Thermo Scientific	140675
24-well tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
96-well tissue culture dish	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
MEM Non-essential amino acids solution	Life Technologies	11140-050
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
2-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Leukaemia inhibitory factor	prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20	Sigma	P1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma	D9542	Protect from light
Mouse anti βIII tubulin IgG antibody	Covance	MMS-435P
Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody	Life Technologies	A31571	Protect from light
25 cm2 tissue culture flask	Thermo Scientific	156367