無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

要約

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

要約

神経前駆細胞にマウス胚性幹細胞（ESC）の分化する能力は、神経の仕様を制御する機構の研究だけでなく、さらなる研究のために成熟した神経細胞型の生成を可能にします。このプロトコルでは、無血清、単層培養を用いて、神経前駆細胞へのESCの分化のための方法を説明します。この方法は効率的で、拡張可能であり、4内の70％の神経前駆細胞〜の産生をもたらす - 6日。これは、様々な条件下で成長させた様々な株からESCに適用することができます。神経前駆細胞は、機能性ニューロンおよびグリアへとさらに分化させ、または顕微鏡検査によって分析し、フローサイトメトリーまたは分子技術を流すことができます。分化過程をタイムラプス顕微鏡検査に適していると神経仕様プロセスを監視するためのレポーター系の使用と組み合わせることができます。私たちはBに処理を可能にするために、メディアの準備と細胞密度の最適化に関する詳細な指示を与えますEは最もESC株および細胞培養容器の様々な適用しました。

概要

胚性幹細胞（キメラを形成することによって）適切な段階の胚に再導入後のすべての成体細胞型に分化する能力を保持しながら、in vitroで無限に増殖する能力を有する初期胚から誘導された多能性細胞、同系または免疫無防備状態の宿主に注入されています適切な手がかりに（奇形腫を形成することにより）、またはインビトロ 、対象における ^1。神経系統へのマウス胚性幹細胞のin vitroでの分化は、1995年に初めて記載され、モルフォゲン、レチノイン酸^2-4を補った血清含有培地中の多細胞懸濁凝集体（胚様体に、EB）の形成を関与していました。それ以来、種々のプロトコルは、神経分化^5を可能にするために開発されてきました。まだ凝集を利用する多くの、他の細胞型を誘導するとの共培養を、いくつかの無血清培地の使用を含みます。すべてのプロトコルの利点持っていますND欠点及び神経または神経細胞の正確な性質は、また、使用するプロトコルに応じて変化する生じました。

理想的なプロトコルは、堅牢で拡張性の高い、完全に定義された培地と基質を利用する、分化過程の非侵襲的モニタリングに適して、外部の手がかりによってパターニングすることができる神経前駆細胞の純粋な集団の生成をもたらすと区別するためであろう比較的短時間で高効率と収率で、すべてのニューロンとグリアサブタイプに。最後の十年では、低密度、無血清の接着性単層培養^6-10にマウスESCから神経前駆細胞と神経細胞を生成するための方法を使用しています。このプロトコルは、上述した多くの基準を満たす：我々の手に分化効率は、長年にわたって非常に一貫しており、種々の細胞株は、スケールアップすることができ、またはダウン（我々が正常に96ウェルプレートから容器を用います直径15cmジシーズ）と使用するメディアは、明確に定義されています。プロセスは、（ドーパミン作動性ニューロン⁶のために、例えば、ShhのとFGF8）ニューロンのサブタイプの別個の種類の生成を誘導するために添加することができる分化のモニタリングおよびパターニング手がかりの様々なタイムラプス顕微鏡に適しています。

それにもかかわらず、このプロトコルの成功のアプリケーションにはいくつかの課題があります。重要な側面の一つは、メディアの入念な準備です。我々は常に商業選択肢の利用可能性にもかかわらず、社内メディアを準備します。使用サプリメントの一つ（N2; プロトコルを参照）は、標準的な市販のバージョンに比べて変更されています。最後に、この方法の成功した適用のために最も重要なステップの一つは、めっきに最適な細胞密度です。誘導信号（FGF4 ^11）のいずれかの自己分泌性質が最適viabilを可能にするのに十分な細胞が存在することを必要とするので、これは主に高すぎる密度分化における性と分化は、（おそらくLIF ¹²の自己分泌産生に起因する部分で）損なわれています。これは、培地調製および細胞のプレーティングの両方が最適な結果を保証するために慎重にかつ一貫して行われることが重要です。

プロトコル

1.メディアの準備

注：プロトコルは、2つの別のメディアのミックスの使用に依存している：変更されたN2サプリメントを補充したDMEM / F12とするNeurobasalは、典型的には1に、B27サプリメントで補充：1の比率。

1. 15mlチューブに成分を混合することによって修正されたN2サプリメントを準備します。これをボルテックスしたりフィルタリングしません。溶液が透明になるまでチューブを転倒混和。
   1. （0.01 M HClに作られた）25 mg / mlのインスリンの1ミリリットルを加え、チューブを反転させてよく混ぜ、その後、DMEM / F12の7.2ミリリットルをピペットで起動します。溶液が透明になるまでには数分かかります。
   2. 100ミリグラムの1ミリリットルを追加/ mlの（水の中に作られた）アポトランスフェリン、0.6ミリグラム/ 33μlのミリリットルprogesternone（エタノール中に作られた）、水に作られた160 mg / mlの（1 M）プトレシン（100μlの）、水の中に作られた3ミリモルの亜セレン酸ナトリウム（）10μlの7.5％ウシ血清アルブミンの666μlを、よくチューブを混ぜます。 -20℃で2.5ミリリットルに小分けとストア最大2ヶ月間C。
2. メディアを準備します。
   1. DMEM / F12 250 mlにN2の2.5ミリリットルを追加します。よく混ぜますが振動やフィルタはありません。
   2. 神経基礎の250ミリリットルにメディアはB27サプリメントの5ミリリットルを追加します。よく混ぜますが振動やフィルタはありません。
   3. 1：1の比のステップ1.2.1と1.2.2からメディアをミックス。いくつかのケースでは1：3混合物は、（：ステップ1.2.4で1ミックス1のように補足した）必要な場合があります。
   4. ミックスにL-グルタミン（最終濃度0.2 mM）の2-メルカプトエタノール（最終濃度0.1 mM）の3.5μlを0.5 mlのを追加し、振盪せずによく混ぜます。 3週間まで4℃でメディアを格納し、光にさらすことは避けてください。この最終的なミックスはN2B27と呼ばれています。
3. ゼラチン溶液を準備します。
   1. 15分間、121℃、15 psiで超純水、オートクレーブ中の1％ゼラチン溶液を準備します。それは、このために使用ボトルは洗浄剤や消毒剤から完全にクリーンであることが重要なので、新しいボトルがあることをお勧めしますこのために使用されるとしか使用の間、超純水でリンスされます。 50ミリリットルのアリコートに1％溶液を分注し、数ヶ月のために4℃で維持。
   2. 溶解するまで37℃の水浴中で1％ゼラチンのアリコートを温め、温かいリン酸緩衝食塩水（PBS）500ml中に加えます。十分に混合し、各ウェルまたはプレートの底をカバーするのに十分ピペット。少なくとも30分間コートにゼラチンを表面を許可します。

2.細胞をプレーティング

注：このプロトコルは、白血病阻害因子（LIF）で10％血清中で増殖させたマウスESC、LIFおよび骨形成タンパク質4（BMP4）またはMEKとGSK3阻害剤（2Iメディア）とLIFまたは無血清培地と血清代替に等しく適用されますでまたはLIFなしで。しかし、分化のタイミングおよび効率は、細胞培地（説明を参照）に依存して変化し得ます。ここに示した実験のために、我々はEGFPレポーターがOにノックした46CマウスESC株を（使用しました10％血清およびLIFとGMEM中で増殖させた内因性SOX1対立遺伝子のNE）。最適な結果のためには、細胞が解離し、N2B27培地中に再プレーティングすることが重要です。単にGMEM /血清/ LIFからN2B27にメディアの変更は、常に細胞を再プレートと比較して減少分化効率をもたらします。

1. 10％血清、1mMピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、0.1 M 2-メルカプトエタノール、100ユニット/ mlのLIF ¹³ GMEM中で細胞を成長させます。 3日- 2かかりますT25培養フラスコにマウスESC、プレート1×10 ⁶細胞のサブコンフルエント培養物を取得します。
2. 明視野顕微鏡で細胞を観察します。細胞がサブコンフルエントと通過する準備ができたら、PBS中で2回、それらをすすぎます。細胞解離試薬の1ミリリットルを追加し、2インキュベーターに戻す - 5分。トリプシンおよび他の酵素は、細胞分離のために用いることができるが、めっき密度があることが必要となるので、それらはadju細胞接着に悪影響を与えることができSTED。
3. 細胞がプレートから持ち上げるために始めているしたら、単一細胞懸濁液にそれらを取り除くために、容器をタップします。 15mlの遠心チューブに培地と細胞解離試薬およびピペットの10ミリリットルの合計に細胞を回収します。
4. RTで3分間、300×gで細胞をスピン。
5. 慎重に上清を吸引し、ピペッティングにより3ダウン予め温めておいたN2B27 10mlにペレットを再懸濁 - 5回。ダウンサスをピペットすると、チューブの側面にピペットは、泡を作成しないように。自動細胞カウンターまたは血球計数器で細胞をカウントし、濃度を記録します。
6. 予め温めておいN2B27にウェルあたりするボリュームの単位当たりの細胞の所望の数を含む細胞懸濁液を準備します。 6ウェルディッシュ中で1cm ²当たり10,500細胞の密度（ すなわち、6ウェル皿のウェル当たり1×10 ^5個の細胞）が最適です。 cm ²であり、PLAあたりの細胞の推奨数については、表1を参照してください。細胞培養容器の様々なティンメディアボリューム。
7. 培養容器からゼラチンを吸引し、 表1で推奨密度とボリュームに応じて細胞懸濁液をプレート。これは中央に細胞を集中するようにプレートを旋回しないでください。 37℃、5％CO ₂の湿潤インキュベーター内で培養を配置します。
8. 新鮮N2B27で全てのメディアを交換することによって、2日 - すべての1のメディアを変更します。ピペットは、細胞を穏やかにフラッシュなどの密度に影響を与え、次の日に分化効率を低下させる可能性があります。めっき後の初期の生存率が悪い場合には、1で細胞をプレート：N2及びB27添加培地の3ミックスと最初の2日後N2B27に変更。細胞が分化するように開始され、4の内部（ここで使用46C細胞株におけるレポーターの緑色蛍光によって可視）SOX1の発現を示すべきである- 6日。

3.免疫蛍光染色

NOTE：プロトコルは、任意の容器型に適用することができます。各試薬の量は、6ウェルプレートのウェル毎に記載されており、任意の表面領域にスケーリングすることができます。再プレーティングは、その後低い生存能力にはお勧めしません。

1. 分化培地を除去し、4％の500μL（v / v）のパラホルムアルデヒドを添加することにより、細胞を固定、15分間放置します。
2. 洗浄し、PBS-T（リン酸緩衝生理食塩水0.5％（v / v）のトゥイーン20）を2 mlの細胞透過性を2回。細胞を4℃で最長2ヶ月間、PBS-T中で維持することができます。
3. 10％（二次抗体と同じ種に由来する）（v / v）の血清をPBS-T 1mlのPBS-Tを交換してください。任意の非特異的結合をブロックするために室温でロッカープレート上で1時間インキュベートします。
4. 1時間後、PBS-Tを2 mlの細胞を2回洗浄し、（1希釈した10％の血清をPBS-Tで1000）、βIIIチューブリンに対する500μlのマウスIgGでインキュベートします。プレートロッカーに入れ、4℃でO / Nのままにしておきます。
5. この段階から、常に血管を保護光から。次に（10％血清をPBS-T中の2μg/ mlに希釈した）蛍光標識抗マウスIgG抗体500μlを添加、PBS-Tで細胞を2回洗浄します。室温で1時間プレートロッカーの上に置きます。
6. その後、DAPIの500μlを添加、PBS-Tで細胞を2回すすぎ（PBS-Tで0.5μg/ mlに希釈し）、5分間のままにします。
7. 再び細胞を洗浄し、PBS-Tに保管してください。細胞を撮影する準備ができていると、4℃で2週間まで維持することができます。それは固定され、生細胞の、又は異なる時間に固定された細胞のGFPの強度を比較することは不適切であるので、GFPシグナルが経時フェード注意。

結果

この実験では、神経分化を追跡するために、内因性SOX1-GFPレポーターと46C細胞ライン^14、マウス胚性幹細胞を使用します。この細胞株、SOX1の発現は、神経前駆細胞のマーカーを使用することにより、緑色蛍光により検出することができます。密度をメッキすることは、神経分化を達成するための重要な要因です。マウス胚性幹細胞は、10,500 88500個の細胞/ cm ²で変化する異なる?...

ディスカッション

単層神経分化プロトコルは、十年⁶オーバーのために使用されてきました。プロトコルが定義された媒体で構成され、前臨床のためのシステムをより適用になり、単層システムで行われ、非常に効率的である（ 例えば、薬物スクリーニング）を使用しています。しかし、分化効率を決定するいくつかの重要な要因があります。この記事では、これらの要因と各障害物のためのソ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01
B-27 Supplement, serum free	Life Technologies	17504-044
Insulin	Sigma	I6634	Reconstitute with sterile 0.01 M HCl
Apo-transferrin	Sigma	T1147	Reconstitute with sterile water
Progesterone	Sigma	P8783	Reconstitute with ethanol
Putrescine	Sigma	P5780	Reconstitute with sterile water
Sodium selenite	Sigma	S5261	Reconstitute with sterile water
Bovine albumin fraction V	Life Technologies	15260-037
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented
Gelatine	Sigma	G1890
6-well tissue culture dish	Thermo Scientific	140675
24-well tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
96-well tissue culture dish	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
MEM Non-essential amino acids solution	Life Technologies	11140-050
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
2-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Leukaemia inhibitory factor	prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20	Sigma	P1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma	D9542	Protect from light
Mouse anti βIII tubulin IgG antibody	Covance	MMS-435P
Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody	Life Technologies	A31571	Protect from light
25 cm2 tissue culture flask	Thermo Scientific	156367