Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

Zusammenfassung

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, embryonalen Stammzellen der Maus zu differenzieren (ESC) zu neuralen Vorläuferzellen ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen, die neuronale Spezifikation sowie die Erzeugung von reifen neuralen Zelltypen für eine weitere Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Unterscheidung von ESC zu neuralen Vorläuferzellen mit Serum-freien, Monokultur. Das Verfahren ist skalierbar, effizient und führt zur Produktion von ~ 70% neuralen Vorläuferzellen innerhalb 4-6 Tagen haben. Es kann zu ESC aus verschiedenen Stämmen unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen angewendet werden. Neuralen Vorläuferzellen kann zugelassen werden, um weiter in funktionelle Neuronen und Glia differenzieren oder analysiert durch Mikroskopie, Durchflusszytometrie oder molekularen Techniken. Der Differenzierungsprozess zugänglich ist Zeitraffermikroskopie und kann mit der Verwendung von Reporter-Linien, um die neuronale Spezifikationsprozess Überwachung kombiniert werden. Wir bieten Ihnen detaillierte Anweisungen, Medienaufbereitung und Zelldichte-Optimierung, damit der Prozess zu be angelegt, um die meisten ESC Leitungen und einer Vielzahl von Zellkulturgefäßen.

Einleitung

Embryonale Stammzellen sind pluripotente Zellen des frühen Embryos mit der Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in vitro proliferieren, abgeleitet, während die Fähigkeit beibehalten wird (durch Bildung einer Chimäre) in alle adulten Zelltypen folgenden Wiedereinführung in einem geeigneten Stadium Embryos differenzieren, die Injektion in syngene oder immunsupprimierten (durch Bildung einer Teratom) oder in vitro unter Umständen von Cues ^1. Die in vitro Differenzierung von embryonalen Maus-Stammzellen zu neuralen Linien wurde erstmals 1995 beschrieben und involviert die Bildung von vielzelligen Aufhängung Aggregate (Embryoid Bodies, EBs) in serumhaltigem Medium mit dem Morphogen Retinsäure ^2-4 ergänzt. Seitdem wurde eine Vielzahl von Protokollen entwickelt, die neuronale Differenzierung ⁵ ermöglichen. Viele noch zu nutzen Aggregation, andere Co-Kultur mit Zelltypen induzieren und mehrere beinhalten die Verwendung von Serum-freien Medien. Alle Protokolle haben Vorteile einnd Nachteile und die genaue Art der neuronalen oder neuronalen Zellen produziert auch variiert in Abhängigkeit von dem verwendeten Protokoll.

Die ideale Protokoll wäre robust, skalierbar und nutzen vollständig definierten Medien und Substrate, sei zugänglich nicht-invasive Überwachung des Differenzierungsprozesses und führen zu der Erzeugung von reinen Populationen von neuronalen Vorläuferzellen in der Lage, durch externe Signale und zur Differenzierung strukturiert werden in allen neuronalen und glialen Subtypen mit hoher Effizienz und Ausbeute in einer relativ kurzen Zeit. In den letzten zehn Jahren haben wir mit Hilfe wurde ein Verfahren zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen und Neuronen aus Maus ESC in einer niedrigen Dichte, Serum-freien anhaftenden Monolayer-Kultur ^6-10. Dieses Protokoll erfüllt viele der oben genannten Kriterien: in unseren Händen die Effizienz der Differenzierung hat ganz konsequent über viele Jahre und eine Vielzahl von Zelllinien wurde, kann nach oben oder unten skaliert werden (wir erfolgreich Schiffe aus Platten mit 96 Vertiefungen zu 15 cm Durchmesser dishes) und die verwendeten Medien sind gut definiert. Das Verfahren ist offen für Zeitraffermikroskopie zur Überwachung der Differenzierung und einer Vielzahl von Strukturierungs Signale hinzugefügt werden, um die Erzeugung von verschiedenen Typen von neuronalen Subtypen (zB Shh und Fgf8 für dopaminerge Neuronen ⁶⁾ zu induzieren.

Dennoch gibt es einige Probleme bezüglich der erfolgreichen Anwendung dieses Protokolls. Einer der wichtigsten Aspekte ist eine sorgfältige Vorbereitung der Medien. Wir bereiten immer die Medien im Haus trotz der Verfügbarkeit von kommerziellen Alternativen. Eine der verwendeten Ergänzungsmittel (N2; siehe Protocol) hat Änderungen gegenüber dem handelsüblichen Fassungen. Schließlich ist einer der wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens die optimale Zelldichte bei der Galvanisierung. Dies liegt hauptsächlich daran, während der autokrinen Natur eines der Induktion Signale (FGF4 ¹¹⁾ erfordert, dass genügend Zellen vorhanden, um eine optimale viabil ermöglichen, sindkeit und Differenzierung, bei zu hohen Dichten Differenzierung (aufgrund autokrine Produktion von LIF ¹² ggf. teilweise) beeinträchtigt. Es ist daher wichtig, dass die beiden Medienherstellung und Zell Plattierung sorgfältig durchgeführt und konstant, um optimale Ergebnisse sicherzustellen.

Protokoll

1. Medien Vorbereitung

ANMERKUNG: Das Protokoll beruht auf der Verwendung einer Mischung aus zwei getrennten Medien: DMEM / F12 mit modifizierten N2 Ergänzung und Neurobasalmedium mit B27 Ergänzung ergänzt ergänzt, typischerweise in einem 1: 1 Verhältnis.

1. Bereiten Sie die modifizierte N2 Ergänzung durch Vermischen der Komponenten in einem 15-ml-Tube. Nicht vortexen oder filtern diese; mischen durch Umdrehen des Röhrchens, bis die Lösung klar ist.
   1. Starten Sie durch Pipettieren von 7,2 ml DMEM / F12, dann fügen Sie 1 ml 25 mg / ml Insulin (in 0,01 M HCl hergestellt) und gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens. Es dauert ein paar Minuten, bis die Lösung klar ist.
   2. 1 ml 100 mg / ml Apo-Transferrin (in Wasser), 33 ul 0,6 mg / ml progesternone (in Ethanol bildete), 100 ul 160 mg / ml (1 M) Putrescin (in Wasser bildete ), 10 ul 3 mM Natriumselenit (in Wasser) und 666 & mgr; l 7,5% Rinderserumalbumin und mischen das Felgenbett. Aliquot in 2,5 ml und bei -20 °C für bis zu 2 Monate.
2. Bereiten Sie die Medien.
   1. Zu 250 ml DMEM / F12 hinzufügen 2,5 ml N2. Gut mischen, aber nicht schütteln oder Filter.
   2. Zu 250 ml Neurobasal Medien 5 ml B27 Ergänzung. Gut mischen, aber nicht schütteln oder Filter.
   3. Mischen Sie die Medien aus den Schritten 1.2.1 und 1.2.2 in einem Verhältnis 1: 1. In einigen Fällen ist eine 1: 3-Mix erforderlich sein (ergänzt als 1: 1-Mischung in Schritt 1.2.4).
   4. Zu der Mischung hinzufügen 0,5 ml L-Glutamin (Endkonzentration 0,2 mM) und 3,5 ul 2-Mercaptoethanol (Endkonzentration 0,1 mM) und gut mischen ohne Schütteln. Lagern Sie das Material bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen und vermeiden, um Licht. Diese Endmischung wird als N2B27.
3. Bereiten Sie die Gelatine-Lösung.
   1. Eine 1% ige Gelatinelösung in Reinstwasser und Autoklaven bei 121 ° C, 15 psi, 15 Min. Es ist wichtig, daß die Flasche für diese verwendet wird, ist vollständig frei von Reinigungsmittel oder Desinfektionsmittel, so empfiehlt es sich, dass eine neue Flasche istdafür verwendet und wird immer nur in Reinstwasser zwischen Gebrauch gespült. Aliquot der 1% igen Lösung in 50 ml-Teilmengen und halten bei 4 ° C für Monate.
   2. Erwärmen ein Aliquot von 1% Gelatine in einem 37 ° C warmen Wasserbad gelöst und in den 500 ml warmem phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Gut mischen und pipettieren genug, um den Boden jeder Vertiefung oder Platte abzudecken. Ermöglichen die Gelatine, die Oberfläche für mindestens 30 min.

2. Ausplattieren der Zellen

Hinweis: Dieses Protokoll gilt auch für die Maus ESC in 10% Serum mit Leukämie (LIF), Serum-Ersatz mit LIF oder Serum-freien Medien mit LIF und bone morphogenetic protein 4 (BMP4) oder MEK und GSK3-Inhibitoren (2i Medien) gewachsen mit oder ohne LIF. Jedoch kann die Zeitsteuerung und die Effizienz der Differenzierung in Abhängigkeit von den Medien und Zellen (siehe Diskussion) variieren. Bei den hier gezeigten Experimenten verwendeten wir den 46C Maus ESC Linie (das hat eine EGFP Reporter klopfte in one der endogenen SOX1 Allele), in GMEM mit 10% Serum und LIF gewachsen. Für optimale Ergebnisse ist es wichtig, dass die Zellen dissoziiert und im N2B27 Medien erneut plattiert; einfaches Ändern von Medien aus GMEM / Serum / LIF zu N2B27 führt immer zu einem reduzierten Differenzierung Effizienz im Vergleich zu Neubelegung der Zellen.

1. Wachsen die Zellen in GMEM mit 10% Serum, 1 mM Natriumpyruvat, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1 M 2-Mercaptoethanol und 100 Einheiten / ml LIF ^13. Um einen subkonfluenten Kultur der Maus ESC, Platte erhalten Sie 1 x 10 ⁶ Zellen in einen T25-Kulturflasche, die stattfinden wird 2 - 3 Werktagen.
2. Beachten Zellen unter Hellfeld-Mikroskop. Wenn die Zellen subkonfluenten und bereit, Durchgang sind, spülen Sie sie zweimal in PBS. 1 ml der Zellabtrennungs Reagenz und zurück in den Inkubator für 2-5 min. Obwohl Trypsin und andere Enzyme können für Zelldissoziation verwendet werden, können sie eine negative Wirkung auf die Zellhaftung aufweisen, so dass die Beschichtungsdichten müssen sein adjusted.
3. Sobald die Zellen beginnen, von der Platte zu heben, tippen Sie auf das Schiff, um sie in eine Einzelzellsuspension zu entfernen. Sammle die Zellen in eine Gesamtmenge von 10 ml Medium und Zelldissoziation Reagenz und Pipette in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
4. Dreh die Zellen bei 300 g für 3 min bei RT.
5. Vorsichtig den Überstand aspirieren und das Pellet in 10 ml vorgewärmtes N2B27 durch Auf- und Abpipettieren 3-5 mal. Beim Pipettieren der Suspension ab, Pipette gegen die Seite des Rohrs zu vermeiden, Blasen zu erzeugen. Zählen Sie die Zellen, die mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer und Erfassung der Konzentration.
6. Bereiten Sie eine Zellsuspension, die die gewünschte Anzahl an Zellen pro Volumeneinheit zu je Vertiefung in vorgewärmten N2B27 plattiert werden. Eine Dichte von 10.500 Zellen pro cm ² in einer 6-Well-Platte (das heißt, 1 x 10 ⁵ Zellen pro Well einer 6-Well-Platte) ist optimal. Siehe Tabelle 1 für die vorgeschlagene Anzahl von Zellen pro cm ² und plaTing Medienvolumina für eine Vielzahl von Zellkulturgefäßen.
7. Saugen Sie das Gelatine aus dem Kulturgefäß und Platte der Zellsuspension nach dem vorgeschlagenen Dichte und Volumen in der Tabelle 1. Wirbeln Sie nicht die Platten, da dies die Zellen an der Mitte zu konzentrieren. Zeigen die Kulturen in einem feuchten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO _2.
8. Ändern Sie alle Medien 1 - 2 Tage durch Ersetzen alle Medien mit frischen N2B27. Pipette vorsichtig wie Spülen der Zellen könnte Dichte beeinflussen und verringern Differenzierung Effizienz in den folgenden Tagen. Wo anfänglichen Lebensfähigkeit nach der Beschichtung schlecht ist, die Platte der Zellen in einem 1: 3-Mix der N2 und B27-Medien ergänzt und geändert werden, um diese N2B27 nach den ersten beiden Tagen. Zellen beginnen zu differenzieren und sollte SOX1 Ausdruck innerhalb von 4 (durch grüne Fluoreszenz des Reporters in der 46C-Zelllinie verwendet werden, hier nicht sichtbar) zeigen - 6 Tage.

3. Immunfluoreszenzfärbung

NEINTE: Das Protokoll kann auf jeden Schiffstyp angewandt werden. Das Volumen von jedem Reagenz pro Vertiefung von 6-Loch-Platte beschrieben und kann auf jede Oberfläche skaliert. Replattierung wird nicht aufgrund der geringen Rentabilität danach empfohlen.

1. Entfernen Differenzierungsmedium und fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% (v / v) Paraformaldehyd, lassen für 15 Minuten.
2. Waschen und Permeabilisierung der Zellen mit 2 ml PBS-T (phosphatgepufferte Salzlösung mit 0,5% (v / v) Tween-20) zweimal. Zellen in PBS-T für bis zu 2 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden.
3. Ersetzen PBS-T mit 1 ml PBS-T mit 10% (v / v) Serum (von der gleichen Spezies wie der sekundäre Antikörper). Inkubiere 1 Stunde auf der Platte Wippe bei RT keine unspezifische Bindung zu blockieren.
4. Nach 1 Stunde, waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS-T, und Inkubation in 500 ul Maus-IgG gegen βIII-Tubulin (verdünnt 1: 1000 in PBS-T mit 10% Serum). Setzen Sie auf dem Teller Wippe, und lassen Sie O / N bei 4 ° C.
5. Von diesem Schritt immer schützen das Gefäßvon Licht. Mit PBS-T wasche die Zellen zweimal, dann fügen 500 ul fluoreszenzmarkierten Anti-Maus-IgG-Antikörper (2 & mgr; g / ml in PBS-T mit 10% Serum, verdünnt). Legen Sie es auf dem Teller Wippe für 1 h bei RT.
6. Mit PBS-T Spülen Sie die Zellen zweimal, dann fügen Sie 500 ul DAPI (0,5 ug / ml verdünnt in PBS-T) und lassen Sie für 5 min.
7. Waschen Sie die Zellen erneut und halten sie in PBS-T. Zellen bereit sind, fotografiert zu werden und kann für bis zu 2 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Beachten Sie, dass GFP-Signal verblasst im Laufe der Zeit, so ist es unangemessen, GFP Intensität der festen und lebende Zellen oder von Zellen zu unterschiedlichen Zeiten fixiert zu vergleichen.

Ergebnisse

In diesem Experiment verwendeten wir den 46C-Zellinie ^14, embryonalen Stammzellen der Maus mit einer endogenen SOX1-GFP-Reporter, um neuronale Differenzierung zu verfolgen. Durch die Nutzung dieser Zelllinie Expression von SOX1, ein Marker für neurale Vorläufer, kann durch grüne Fluoreszenz detektiert werden. Plattierungsdichte ist ein kritischer Faktor, um die neuronale Differenzierung zu erreichen. Embryonale Stammzellen der Maus wurden in 6-Well-Platte bei unterschiedlicher Dichte reicht von 10.500 bis ...

Diskussion

Die Monoschicht neuronalen Differenzierung Protokoll wird seit mehr als einem Jahrzehnt ⁶ gewesen. Das Protokoll ist sehr leistungsfähig, von definiertem Medium zusammengesetzt ist und in einer Monoschicht-System, das das System eher für präklinische macht gemacht (zB Arzneimittel-Screening) verwendet. Es gibt jedoch einige wichtige Faktoren, die die Differenzierung Effizienz zu bestimmen. Dieser Artikel weist darauf hin, die Faktoren und die Lösung für jedes Hindernis.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01
B-27 Supplement, serum free	Life Technologies	17504-044
Insulin	Sigma	I6634	Reconstitute with sterile 0.01 M HCl
Apo-transferrin	Sigma	T1147	Reconstitute with sterile water
Progesterone	Sigma	P8783	Reconstitute with ethanol
Putrescine	Sigma	P5780	Reconstitute with sterile water
Sodium selenite	Sigma	S5261	Reconstitute with sterile water
Bovine albumin fraction V	Life Technologies	15260-037
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented
Gelatine	Sigma	G1890
6-well tissue culture dish	Thermo Scientific	140675
24-well tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
96-well tissue culture dish	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
MEM Non-essential amino acids solution	Life Technologies	11140-050
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
2-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Leukaemia inhibitory factor	prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20	Sigma	P1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma	D9542	Protect from light
Mouse anti βIII tubulin IgG antibody	Covance	MMS-435P
Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody	Life Technologies	A31571	Protect from light
25 cm2 tissue culture flask	Thermo Scientific	156367