Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

Özet

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Özet

nöral progenitörlerin fare embriyonik kök hücreleri ayırt etmek yeteneği (ESC) nöral özellikleri yanı sıra, daha fazla çalışma için olgun nöral hücre tiplerinin üretimini kontrol eden mekanizmaların çalışmasını sağlar. Bu protokolde serum serbest, tek tabaka kültürü kullanarak sinir atalarıdır için ESC farklılaşması için bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem, etkili, ölçeklenebilir ve 4 içinde% 70 nöral projenitör hücrelerinin ~ üretimi ile sonuçlanır - 6 gün. Bu, çeşitli koşullar altında yetiştirilen çeşitli suşlardan ESC uygulanabilir. Sinir progenitörler, mikroskopla fonksiyonel nöronlar ve glia veya analiz içine daha ayırt sitometri veya moleküler teknikler akmasına izin verilebilir. farklılaşma süreci zaman atlamalı mikroskopi için uygun olduğunu ve nöral şartname sürecini izlemek üzere raportör hatlarının kullanımı ile kombine edilebilir. Biz sürecin b izin medya hazırlanması ve hücre yoğunluğu optimizasyonu hakkında ayrıntılı yönergeler sağlarE en ESC hatları ve hücre kültür kapları çeşitli uygulanan.

Giriş

Embriyonik kök hücreler, sinjeneik ya da bağışıklık yetersizliği konaklara (a Kimera oluşturarak) uygun bir aşamada embriyo yeniden yerleştirilmesi, aşağıdaki tüm yetişkin hücre tiplerine farklılaşma yetisine, enjeksiyon koruyarak, in vitro olarak sonsuza çoğalma kapasitesi ile erken embriyodan türetilen pluripotent hücreler (Bir teratom oluşturarak) ya da uygun işaretlere ¹ in vitro konu. Nöral soy içine fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaşması ve 1995 tarif edilmiştir ve morfojen retinoik asit ile takviye edilmiş ^2-4 serum ihtiva eden ortam içinde çok-hücreli süspansiyon agregatların oluşumunu (embriyoid organları, EBS) yer aldı. O zamandan bu yana çeşitli protokoller nöral farklılaşma ⁵ izin vermek için geliştirilmiştir. Hala toplanmasını kullanmak Birçok diğerleri hücre tipleri indükleyici ile-kültür co ve çeşitli serum serbest medya kullanımını içerir. Tüm protokoller avantajlara bir olmasınd dezavantajları ve sinirsel hassas doğası veya nöronal hücreleri de kullanılan protokole göre değişir üretti.

İdeal protokol, sağlam ölçeklenebilir olması ve tam olarak tanımlanmış medya ve yüzeylerde faydalanmak, farklılaşma sürecinin non-invazif izleme için uygun olmalı ve mümkün sinirsel atalarıdır saf popülasyonlarının nesil neden dış ipuçlarının tarafından ve ayırt desenli olmak istiyorum nispeten kısa bir süre içinde yüksek verim ve verim bütün nöronal ve glial alt tiplere. Son düzine yıllarda biz bir düşük yoğunluklu, serum serbest yapışık tek tabaka kültürü ^6-10 fare ESC nöral atalarıdır ve nöronlar üretmek için bir yöntem kullanıyoruz. Bu protokol, yukarıda belirtilen kriterler içinde, birçok yerine getirir: Elimizdeki farklılaşma verimliliği oldukça uzun yıllar boyunca tutarlı ve hücre çizgileri, çeşitli olmuştur, bu yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir edilebilir (başarıyla 96 oyuklu plakalar, damar kullanımı 15 cm çapında dio kız) ve kullanılan ortam iyi tanımlanmış bulunmaktadır. süreci (dopaminerjik nöronların ⁶ örneğin, Shh ve FGF8) nöronal alt tiplerinin farklı tiplerinin üretimini indüklemek için ilave edilebilir farklılaşma izlenmesi ve desen ipuçlarının çeşitli timelapse mikroskopi elverişlidir.

Yine, bu protokolün başarılı bir uygulama için bazı zorluklar vardır. Anahtar yönlerinden biri medyanın dikkatli bir hazırlık olduğunu. Biz her zaman ticari alternatiflerin varlığına rağmen içi ortam hazırlar. Kullanılan takviyeleri biri (N2; Protokolü bakınız) standart piyasada mevcut sürümleri üzerinde değişiklikler vardır. Son olarak, bu yöntemin başarılı bir uygulama için en önemli adımlardan biri kaplama optimum hücre yoğunluğudur. Uyaran sinyallerin biri (Fgf4 ¹¹⁾ otokrin yapısı gerektirirken, bu yeterli hücre uygun viabil izin vermek için mevcut olması esas olarakçok yüksek yoğunlukları farklılaşma de Sığ ve farklılaşma, (nedeniyle LIF ¹² otokrin üretimine muhtemelen kısmen) bozulur. Hem medya hazırlama ve hücre kaplama özenle yapılır ve sürekli optimum sonuçlar sağlamak için bu nedenle önemlidir.

Protokol

1. Medya Hazırlık

Not:: 1 oranında, tipik olarak 1, B27 eki ile takviye modifiye N2 ek ve Neurobasal ile desteklenmiş DMEM / F12: Protokol iki ayrı ortam karışımı kullanımına dayanır.

1. 15 ml'lik bir tüp içinde bileşenlerin karıştırılması ile değiştirilmiş N2 ek hazırlayın. Vorteks veya bu filtre etmeyin; çözüm netleşene kadar tersini tüp karıştırın.
   1. Daha sonra, (0.01 M HCl içinde yapılır) 25 mg / ml insülin 1 ml ilave edilir ve tersini tüp iyice karıştırın, DMEM / F12 içinde 7.2 ml pipetleme başlayın. Çözelti berrak olana kadar bu birkaç dakika sürer.
   2. (Su içinde oluşan), 100 mg, 1 ml / ml apo-transferrin, mi progesternone (etanol içinde oluşan) / 0.6 mg 33 ul, 160 mg / ml (1 M), putreskin, 100 ul (su içinde yapılan ), 10, su içinde yapılır 3 mM sodyum selenit () ve% 7.5 sığır serum albümini 666 ul ul ve de tüp karıştırın. -20 ° 2.5 ml kısım ve mağaza2 aya kadar ısıtılır.
2. Ortamı hazırlayın.
   1. DMEM / F12 içinde 250 ml'lik bir N2 2.5 ml. İyice karıştırın ama sallamak ya da filtre yoktur.
   2. Neurobasal 250 ml'lik ortam B27 ek 5 ml ekleyin. İyice karıştırın ama sallamak ya da filtre yoktur.
   3. : 1 oranında bir 1 adım 1.2.1 ve 1.2.2 medya karıştırın. 1 Bazı durumlarda: 3 karışım gerekebilir (: Adım 1.2.4 1 mix 1 olarak desteklenmiş).
   4. Karışımına L-glutamin (son konsantrasyon 0.2 mM) ve 2-merkaptoetanol (nihai konsantrasyon 0.1 mM) 3.5 ul 0.5 ml ilave edilir ve çalkalamadan iyice karıştırın. En fazla 3 hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilir ve ortam ışığına maruz kaçının. Bu son karışım N2B27 olarak adlandırılır.
3. Jelatin çözeltisi hazırlayın.
   1. 15 dakika boyunca, 121 ° C, 15 psi, ultra saf su ve otoklav içinde% 1 jelatin çözeltisi hazırlayın. Bunun için kullanılan şişe deterjan veya dezenfektan tamamen temiz olması önemlidir, bu yüzden yeni bir şişe tavsiye edilirBu işlem için kullanılan ve sadece hiç kullanımlar arasında, aşırı saf su içinde çalkalanır. 50 ml'lik miktarlar halinde% 1 çözeltisi eş-payı ve ay için 4 ° C'de tutun.
   2. Çözülene kadar 37 ° C su banyosu içinde,% 1 jelatin bir kısım ısıtın ve ılık fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 500 ml ekle. İyice karıştırın ve iyi ya da plaka her alt karşılamak için yeterli pipetlemeyin. En az 30 dakika süreyle kaplamak için jelatin satıh izin verir.

2. Hücreler Kaplama

NOT: Bu protokol, lösemi önleyici faktör (LİF), LİF ve kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) veya MEK ve GSK3 inhibitörlerinin (2R ortam) sahip LIF ve serumsuz ortam ile, serum yerine% 10 serum içinde yetiştirilen fare ESC için de geçerlidir veya LİF yoktur. Bununla birlikte, farklılaşma zamanlaması ve verimlilik ortam ve hücreler (tartışmaya bakınız) bağlı olarak değişebilir. Burada gösterilen deneyler için biz bir EGFP muhabiri o içine çaldı vardır (46C fare ESC hattını kullanılan% 10 serum ve LİF ile GMEM yetiştirilen endojen Sox1 allel NE). En iyi sonuçlar için, hücreler ayrılmış ve N2B27 ortam içinde yeniden kaplanmıştır olması önemlidir; N2B27 zaman hücrelerin şarjı ile karşılaştırıldığında daha düşük bir farklılaşma verimi ile sonuçlanır basitçe GMEM / serum / LİF ortamların değiştirilmesi.

1. % 10 serum, 1 mM sodyum piruvat, 1 x esansiyel olmayan amino asitler ile GMEM hücreler büyümek 0.1 M 2-merkaptoetanol ve 100 birim / ml LİF ^13. Fare ESC, plaka SUBCONFLUENT kültürünü almak için 2 götürecek bir T25 kültür balona 1 x 10 ⁶ hücre - 3 gün.
2. Aydınlık alan mikroskobu altında hücreleri gözlemleyin. Hücreler geçişine SUBCONFLUENT ve hazır olduğunuzda, PBS içinde iki kez yıkayın. Hücre ayrışma reaktifi 1 ml ilave edilir ve 2 için inkübatöre geri - 5 dak. Tripsin ve diğer enzimler de hücre ayrılma için kullanılabilmesine rağmen kaplama yoğunlukları olması gerekir, bu yüzden onlar Adju hücre eki üzerinde olumsuz bir etkisi olabilirsted.
3. Hücreler plaka kaldırmaya başlıyor sonra, tek bir hücre süspansiyonu içine çıkarmak için gemi dokunun. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine ortam ve hücre ayrışma reaktif ve pipet 10 ml toplam içine hücreleri toplamak.
4. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'de hücreleri dönerler.
5. Dikkatle süpernatant aspire ve aşağı 3 yukarı pipetleme tarafından önceden ısıtılmış N2B27 10 ml pelletini - 5 kez. Aşağı süspansiyon pipetleme yaparken, tüpün kenarına pipet hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için. Otomatik hücre sayacı veya haemocytometer ile hücre sayımı ve konsantrasyon kaydedin.
6. Birim hacim başına hücre istenen sayıda ihtiva eden bir hücre süspansiyonu önceden ısıtılmış N2B27 içinde oyuk başına kaplama için hazırlayın. 6-çukurlu tabak ^cm2 başına 10,500 hücre olan bir yoğunlukta (yani, 6-çukurlu tabak oyuk başına 1 x 10 ⁵ hücre) en uygunudur. ^Cm2 ve pla başına hücre önerilen sayıda Tablo 1'e bakınızHücre kültürü damarlarının çeşitli ting medya hacimleri.
7. Kültür kabından jelatin aspire ve Tablo 1'de önerilen yoğunluğu ve hacmine göre hücre süspansiyonu plaka. Bu merkeze hücreleri konsantre olacak gibi plakaları girdap etmeyin. 37 ° C'de,% 5 _CO2 de nemli bir inkübatörde kültür yerleştirin.
8. Taze N2B27 ile tüm medya değiştirerek 2 gün - her 1 ortam değiştirin. Pipet hafifçe yoğunluğunu etkiler ve önümüzdeki günlerde farklılaşma verimliliği azaltmak olabilir hücreleri kızarma olarak. Kaplama sonraki ilk canlılık yoksul olduğu durumlarda, 1 hücreleri plaka: N2 ve B27-desteklenmiş medya 3 karışımı ve ilk iki gün sonra N2B27 bu değiştirin. Hücreler ayırt başlayacak ve 4 içinde (burada kullanılan 46C hücre hattında muhabiri yeşil floresan görünür) Sox1 ifadesini göstermesi gerekir - 6 gün.

3. Immunofluorescent Boyama

HAYIRTE: protokol her gemi tipine uygulanabilir. her reaktif hacmi 6-çukurlu plaka içinde çukur başına anlatılan herhangi bir yüzey alanına ölçeklendirilebilir. Şarjı sonradan düşük canlılığı nedeniyle tavsiye edilmez.

1. Farklılaşma Ortamı çıkarın ve 4,% 500 ul (h / h) paraformaldehit eklenerek hücrelerin tespit, 15 dakika boyunca bırakın.
2. Yıkayıp ((hac / hac) Tween-20% 0.5 fosfat tamponlu tuzlu su), iki kez PBS-T 2 ml hücre geçirgenliği. Hücreler, 4 ° C'de 2 aya kadar PBS-T içinde tutulabilir.
3. % 10 (sekonder antikor ile aynı türden) (v / v) serumu ile PBS-T, 1 ml PBS-T değiştirin. Herhangi bir spesifik olmayan bağlanma bloke etme oda sıcaklığında levha rocker 1 saat inkübe edin.
4. 1 saat sonra, PBS-T 2 ml hücreler iki kez yıkayın ve βIII-tubulin karşı 500 ul fare IgG inkübe (:% 10 serum ile PBS-T içinde 1000: 1 seyreltilmiş). Plaka rocker koyun ve 4 ° C'de O / N bırakın.
5. Bu adımdan itibaren, her zaman gemiyi korumakışıktan. Daha sonra (% 10 serum ile PBS-T içinde 2 ug / ml'ye seyreltilmiş) floresan-etiketli anti-fare IgG antikoru 500 ul PBS-T ile hücreler iki kez yıkanır. Oda sıcaklığında 1 saat plaka rocker koy.
6. Daha sonra DAPI 500 ul PBS-T ile hücreler iki kez yıkayın (PBS-T içinde 0.5 ug / ml'ye seyreltilmiş) ve 5 dakika boyunca bırakın.
7. Tekrar hücreleri yıkayın ve PBS-T saklayın. Hücreler çekilmeye hazır olduğunu ve 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir. Bu sabit ve canlı hücre ya da farklı zamanlarda, sabit hücrelerde GFP yoğunluğunu karşılaştırma uygunsuz şekilde GFP sinyali, zaman içerisinde kaybolur edin.

Sonuçlar

Bu deneyde, nöral farklılaşma izlemek için, bir endojen Sox1-GFP raportör ile, fare embriyonik kök hücreleri 46C hücre hattı ¹⁴ kullanılır. Sox1 nöral progenitor için bir marker Bu hücre hattı, ifade kullanılarak, yeşil floresan tespit edilebilir. Yoğunluğu Kaplama nöronal farklılaşma elde etmek için kritik bir faktördür. Fare embriyonik kök hücreleri / ^cm2 10,500 88.500 hücre arasında değişen farklı yoğunluklarda 6-çukurlu plaka içinde plakalanmıştır. ...

Tartışmalar

tek tabaka sinir farklılaşma protokolü on üzerinden ⁶ kullanımda olmuştur. Protokol tanımlanan ortam oluşan ve pratik için sistem daha uygulanabilir kılan bir tek-tabakalı sistemde yapılır, yüksek verimli (örneğin, ilaç tarama) kullanır. Ancak, farklılaşma etkinliğini belirleyen bazı kritik faktörler vardır. Bu makalede, bu faktörleri ve her engel için çözüm işaret ediyor.

Farklılaşma durumu kaplama sonrası hücrelerin yoğunluğu belki de...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01
B-27 Supplement, serum free	Life Technologies	17504-044
Insulin	Sigma	I6634	Reconstitute with sterile 0.01 M HCl
Apo-transferrin	Sigma	T1147	Reconstitute with sterile water
Progesterone	Sigma	P8783	Reconstitute with ethanol
Putrescine	Sigma	P5780	Reconstitute with sterile water
Sodium selenite	Sigma	S5261	Reconstitute with sterile water
Bovine albumin fraction V	Life Technologies	15260-037
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented
Gelatine	Sigma	G1890
6-well tissue culture dish	Thermo Scientific	140675
24-well tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
96-well tissue culture dish	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
MEM Non-essential amino acids solution	Life Technologies	11140-050
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
2-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Leukaemia inhibitory factor	prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20	Sigma	P1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma	D9542	Protect from light
Mouse anti βIII tubulin IgG antibody	Covance	MMS-435P
Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody	Life Technologies	A31571	Protect from light
25 cm2 tissue culture flask	Thermo Scientific	156367