إنتاج Nurr-1 بولكلونل محددة الأجسام المضادة الحرة عبر التفاعل مقابل نظرائه Homologs إغلاق Nor1 وNur77

Summary

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Abstract

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Introduction

عامل النسخ Nurr1 وhomologs لها (Nur77 وNor1) تنتمي إلى فصيلة 4A مستقبلات النووي (NR4A) ^1. بل هي أيضا مستقبلات اليتيمة لأنه لم يتم التعرف على بروابط الذاتية حتى الآن. تم استنساخ Nurr1 لأول مرة في عام 1992، وعلى الرغم من أن المعروف أن أعرب في الدماغ ^2، تم الكشف عن دورها الأساسي للتنمية وصيانة الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​من الدراسات الماوس خروج المغلوب ^3. بالإضافة إلى ذلك، دورها المهم في الحفاظ على الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​وقد تجلى مؤخرا دراسة خروج المغلوب الشرطية ^4. ونتيجة لهذه الدراسات أنيقة تظهر الأدوار Nurr1 الحاسمة لالخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط، وركزت العديد من الدراسات اللاحقة إلى حد كبير على الخلايا العصبية الدوبامين والمرتبطة الدوبامين اضطراب الاعصاب الدماغ المتوسط، ومرض باركنسون (PD) ^5.

والجدير بالذكر، وأعرب عن Nurr1 ليس فقط في الدماغ المتوسط ​​الدوبامين (MDA) الخلايا العصبية، ولكن أيضا في ديمناطق الدماغ الآية ^2، مما يشير إلى أنه قد يكون الأدوار الوظيفية في كثير من المجالات غير DA، الذي يحظى بدعم قوي من الدراسات الحديثة تبين أن Nurr1 يلعب دورا هاما في وظائف المخ المختلفة. فعلى سبيل المثال، تبين أن الأنشطة يحفز الذاكرة مثل التعلم، أو غيرها من المهام التابعة الحصين، يؤدي إلى ما يصل تنظيم Nurr1 التعبير في الحصين ^6،7. بالإضافة إلى ذلك، نهدم من Nurr1 التعبير في قرن آمون كانت كافية ليضعف الذاكرة على المدى الطويل و / أو اللدونة متشابك ^11/08، مما يوحي بقوة بأن Nurr1 تلعب أدوارا متنوعة في العديد من مناطق الدماغ. وبالتالي، إلى زيادة فهم التعبير خلية من نوع معين والتحت خلوية من Nurr1، فمن المستحسن استخدام الأجسام المضادة Nurr1 محددة، الذي لا يحمل أي-التفاعل عبر لhomologs لها Nur77 أو Nor1. وتصف هذه الورقة بروتوكول قبل الامتزاز لتوليد الأجسام المضادة Nurr1 محددة وبيانات إضافية الحالية تظهر خصوصيته.

Protocol

ملاحظة: تكوين جميع الحلول المذكورة أدناه يمكن العثور عليها في جدول المواد / المعدات.

1. البروتين عمود جسم تنقية

1. تتوازن بروتين A عمود الدوران وجميع المخازن المطلوبة لدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل البدء في إجراء.
2. تمييع الدم المناعي 1: 1 مع بروتين A مفتش الاحتياطي ملزم. (5 مل من الدم ويوصى).
3. بلطف استفادة من البروتين وعمود الدوران على رأس مقاعد البدلاء لطرد أي راتنج التي قد تكون عالقة في الحد الأقصى. إزالة الغطاء العلوي وبرفق قبالة إغلاق أسفل. وضع عمود في أنبوب جمع 15 مل والسماح حلول التخزين لاستنزاف.
4. إضافة 5 مل من البروتين A مفتش الاحتياطي ملزم والسماح للحل لاستنزاف.
5. تطبيق المصل المناعي المخفف إلى العمود وجمع من خلال تدفق. للحصول على أفضل النتائج، إضافة حجم العينة التي تحتوي على تركيز الأجسام المضادة تقل عن 80٪ من الأجسام المضادة ملزم capacit العمودذ.
6. غسل العمود مع 15 مل من البروتين A مفتش الاحتياطي ملزم أو حتى الامتصاصية في 280 نانومتر هو أقل من 0.1.
7. إضافة 100 ميكرولتر من تحييد مؤقت لخمسة أنابيب جمع المسمى.
8. إضافة 5 مل من مفتش شطف العازلة للبروتين عمود وجمع 1 مل الكسور في كل من الأنابيب التي تحتوي على 100 ميكرولتر من تحييد العازلة.
9. قياس الامتصاصية من كل جزء في 280 نانومتر كسور وتجمع مع الامتصاصية أكبر من 0.5. الحفاظ على الكسور المجمعة على الجليد لتصبح جاهزة للغسيل.
10. تجديد العمود بإضافة 8 مل من مفتش الاحتياطي شطف والسماح للحل لتتدفق من خلال العمود.
11. شطف العمود مع البروتين A مفتش حل ملزم حتى يعود شاطف الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
12. تخزين العمود عن طريق إضافة 5 مل من محلول التخزين (0.02٪ أزيد الصوديوم في PBS). عندما تبقى حوالي 3 مل في العمود، أسفل الغطاء وتأمين الغطاء العلوي. تخزين العمود في 4 ° C.
13. تحديد طول سو أنابيب غسيل الكلى حاجة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. باستخدام 16 مم شقة أنابيب استخدام 5.47 سم من طول الأنبوب الواحد مل من محلول أن مدال. قطع الأنابيب وشطف مع PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
14. اضعاف ومشبك واحدة من نهاية الأنبوب غسيل الكلى، ونقل مفتش المجمعة التي تحتوي على كسور لغسيل الكلى أنابيب معايرتها في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة وإغلاق الطرف الآخر.
15. Dialyze في درجة حرارة الغرفة ضد 200 مجلدا من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 لمدة 2 ساعة.
16. تغيير العازلة غسيل الكلى (الطازجة PBS درجة الحموضة 7.4) وdialyze للساعة 2 آخر في درجة حرارة الغرفة.
17. تغيير العازلة غسيل الكلى (الطازجة PBS درجة الحموضة 7.4) وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
18. الحفاظ على حل الضد مدال في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للشروع في اتخاذ مزيد من الخطوات لتنقية.
19. تقييم تركيز الأجسام المضادة باستخدام الامتصاصية له عند 280 نانومتر، ومعامل الامتصاص المولي من الأجسام المضادة في 280 نيوتن متر من 210000 M ^-1 سم ^{-1 12.}

2. اقتران من الائتلاف الحزبي البروتينات إلى AminoLink اقتران الراتنج

1. إعداد عمودين، واحدة للNor1 والآخر للNur77. اتبع نفس البروتوكول لكل من البروتينات.
2. ذوبان الجليد البروتين إلى أن يقترن إلى الراتنج على الجليد. تحديد تركيز البروتين باستخدام لها معامل الانقراض المولي والامتصاصية لها عند 280 نانومتر ^12.
   1. بدلا من ذلك، استخدم فحص تقرير البروتين مثل فحص الحمض bicinchoninic ^13. إذا تم حل البروتين في تبادل المحتوية على أمين المخزن dialyze أو رادع ضد العازلة اقتران. إذا كان البروتين هو في منطقة عازلة مناسبة (لا الأمينات الحرة) تمييع 4 أضعاف في اقتران العازلة.
3. استخدام 2 مل من الراتنج ل2 ملغ من البروتين. جميع الخطوات التي تتبع هي لراتنج 2 مل في العمود 10 مل. ما يصل إلى 10 ملغ من البروتين يمكن أن تكون مرتبطة لكل 1 مل من الراتنج (2 مل 1: 1 الطين).
4. يعد العمود 10 مل عن طريق دفع فريت الى الاسفل، وتشغيل PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 من خلال ذلك. كاب ركان الجزء السفلي من العمود وإضافة 2 مل من اقتران العازلة.
5. إضافة حجم المطلوب من الطين (4 مل من الحصول على 2 مل من الراتنج) إلى العمود، وإزالة الغطاء السفلي والسماح للاستنزاف العمود. شطف العمود مع ما مجموعه 6 مل (حجم 3 الراتنج سرير) من اقتران العازلة والسماح العمود إلى استنزاف. بعد أن استنزفت المخزن المؤقت اقتران، استبدال الغطاء السفلي.
6. إضافة 2-4 مل من البروتين معلقة في مخزن توصيلات إلى العمود (الحفاظ على قسامة من الحل البروتين لتقييم كفاءة اقتران بمقارنة تركيز البروتين من شطافة في الخطوة 2.11 باستخدام إما الامتصاصية في 280 نانومتر أو مقايسة bicinchoninic) . سقف وتخلط نهاية على نهاية لدينا حل متجانس.
7. تزن فارغة 1.8 مل أنبوب microcentrifuge والانتقال إلى غطاء الدخان. نقل بعناية NaCNBH ₃ (حوالي 0.05 غ) في أنبوب وزنه قبل. إغلاق الأنبوب وتزن الأنبوب الذي يحتوي NaCNBH _3. لا تقم بفتح أنبوب خارج غطاء محرك السيارة.
8. بناء على وزنNaCNBH ₃ نقل في أنبوب، وجعل 5 M حل عن طريق إضافة 1 M هيدروكسيد الصوديوم. الوزن الجزيئي للNaCNBH ₃ هو بالتالي 62.84 ز ز 0.05 يساوي (0.05 / 62.84 = 7.96 × 10 ^-4 الشامات) 7.96 × 10 ^-4 الشامات. لجعل 5 M حل الاعلان (7.96 × 10 ^-4/5) 159 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
9. قياس إجمالي حجم رد الفعل وأخذ حجم الراتنج بعين الاعتبار. إضافة 10 ميكرولتر من 5 M NaCNBH ₃ في مل من رد الفعل.
   1. على سبيل المثال: لحجم رد الفعل 4 مل إضافة 40 ميكرولتر من 5 M NaCNBH _3. ل1 مل من الراتنج و 3 مل من البروتين وأضاف، أن إجمالي حجم هو 4 مل.
10. تتويج العمود وتخلط نهاية على نهاية. تأمين عمود على محور دوار أنبوب وترك يستمر التفاعل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
11. في الصباح، وجلب العمود إلى غطاء الكيميائية وبعناية إزالة الغطاء عن بعض الغاز قد شكلت. استنزاف العمود في أنبوب نظيفة وحفظ شطافة لقياس البروتين يخدعوحدانية التركيز باستخدام الامتصاصية في 280 نانومتر طريقة ¹² أو فحص الحمض bicinchoninic ومقارنتها مع تركيز البروتين بدء في الخطوة 2.6.
12. غسل الراتنج مع 4 مل من اقتران العازلة والسماح للاستنزاف العمود.

3. حجب المواقع المتبقية

1. غسل الراتنج مع 4 مل من التبريد العازلة. استنزاف واستبدال الغطاء السفلي. إضافة 2 مل من التبريد العازلة ووقف الراتنج.
2. تقييم إجمالي حجم رد الفعل من خلال قياس حجم الراتنج وحجم العازلة التبريد ثم إضافة 10 ميكرولتر من 5 M NaCNBH ₃ في مل من حجم رد الفعل.
3. المزيج بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة نهاية الإفراط في نهاية المطاف. بعد 30 دقيقة، وجلب العمود في غطاء الدخان. إزالة بعناية الاعلى و من ثم إزالة الغطاء السفلي والسماح للاستنزاف عمود في أنبوب النفايات.
4. يغسل العمود مع 5 مجلدات الراتنج من غسل الحل. مراقبة يغسل عن وجود البروتينات المتبقية عن طريق قياس abso شطافة لrbance في 280 نانومتر. يتم غسلها البروتينات وفكت بها تركيز عال الملح.
5. غسل الراتنج مع 6 مل من نزع الغاز PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 يحتوي على 0.02٪ أزيد الصوديوم. الحفاظ على العمود في 4 ° C لحين الحاجة إليها.

4. تنقية Nurr1 الاجسام المضادة المحددة

1. شطف جانب العمود Nur77 الائتلاف الحزبي مع 10 مل من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4، والسماح للاستنزاف العمود. سقف الجزء السفلي من العمود ووضع Nur77 الائتلاف الحزبي العمود جانب ينضب في جديد 15 مل أنبوب جمع.
2. إضافة 5 مل من البروتين وتنقية الأجسام المضادة لمكافحة Nurr1، وكأب العمود ومكان على محور دوار عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تنزع الأغطية العلوية والسفلية وجمع التدفق من خلال. توضع جانبا على الجليد حتى جاهزة للإضافة إلى العمود جانب Nor1 الائتلاف الحزبي.
3. شطف جانب العمود Nor1 الائتلاف الحزبي مع 10 مل من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4، والسماح للاستنزاف العمود. سقف الجزء السفلي من العمود ووضع Nor1 الائتلاف الحزبي العمود جانب في أنبوب جمع 15 مل.
4. إضافة تدفق من خلال من الانقلاب Nur77 الائتلاف الحزبيالعمود أدى، وكأب العمود ومكان على محور دوار عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تنزع الأغطية العلوية والسفلية وجمع التدفق من خلال.
5. قياس تركيز الأجسام المضادة عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر.

التحليل الذي يعتمد ELISA 5. من تنقية مكافحة Nurr1 جسم

1. إضافة 100 ميكرولتر من البروتين (2،5 ميكروغرام / مل) إلى الآبار من 96 لوحة جيدا. إذا اختبار 3 البروتينات المختلفة، إضافة 100 ميكرولتر من البروتين 1 إلى الآبار A1 إلى H4، 100 ميكرولتر من البروتين 2، لآبار A5 إلى H8 و 100 ميكرولتر من البروتين 3 إلى الآبار A9 إلى H12. تغطية لوحة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2. غسل الآبار المغلفة مرتين مع 300 ميكرولتر لكل بئر من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وإضافة 300 ميكرولتر من ELISA عازلة عرقلة للمستضد كامل الآبار المغلفة واحتضان 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
3. في حين أن لوحة يتم حظر إعداد التخفيف بدءا المطلوب من تنقية مكافحة Nurr1 الأجسام المضادة (تتراوح بين 10 و 100 ميكروغرام / مل) في ELISA عازلة حظر.
4. بعد 2 ساعة من حظر، استبدال كتلة عازلة ELISA مع 100 ميكرولتر من الطازجة كتلة عازلة ELISA لجميع الآبار.
5. إضافة 100 ميكرولتر من المخفف تنقية مكافحة Nurr1 أجسام مضادة لجميع الآبار في الصف A. مخفف تسلسليا الأجسام المضادة عن طريق نقل 100 ميكرولتر من محلول من الصف ألف من الآبار في الصف B يليه نقل 100 ميكرولتر من محلول من صف إلى صف B C مواصلة السير إلى صف G. بعد خلط الحلول في الآبار في الصف G تجاهل الإضافية 100 ميكرولتر. الآبار في الصف H يحصلون إلا على 100 ميكرولتر الأولية من عرقلة العازلة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
6. غسل لوحة ثلاث (3) مرات مع 300 ميكرولتر لكل بئر من توين 20 بنسبة 0.05٪ في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وصمة عار لوحة لإزالة غسل العازلة الزائد.
7. إضافة 100 ميكرولتر من الفجل البيروكسيد (HRP) مترافق الماعز مفتش المضادة للأرنب الواحد في ELISA كتلة عازلة (1: 8000 تخفيف، ومدى محدد من 1: 5000 إلى 1: 25000). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
8. غسل عشر لوحةري (3) مرات كما هو موضح في 5.6. شطف جميع الآبار عن طريق ملء لهم مع 300 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. وصمة عار الماء الزائد عن طريق لوحة للقلب على امتصاص الورق.
9. إضافة 100 ميكرولتر من 3، 3، 5، 5 'tetramethylbenzidine (تحسنت إلى درجة حرارة الغرفة) لجميع الآبار واحتضان 15-30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
10. وقف رد الفعل من خلال إضافة 50 ميكرولتر من 2 NH ₂ SO _4.
11. قراءة الامتصاصية في 450 نانومتر طرح الخلفية في 650 نانومتر.

النتائج

مقارنة بين البروتين عمود تنقية الأجسام المضادة Nurr1 محددة مع البروتين المنقى أضداد Nurr1 تليها المرور عبر Nur77 الائتلاف الحزبي والأعمدة Nor1 الائتلاف الحزبي هو مبين في الشكل 1. كما يمكن أن يرى، البروتين المنقى A Nurr1 الأجسام المضادة أظهرت ملزم قوية لNurr1 الائتلاف الحز...

Discussion

نجاح هذا البروتوكول يعتمد على توافر البروتينات النقية لتوصيف الأجسام المضادة التي أثيرت ضد عضو محدد من عائلة البروتينات المثيرة للاهتمام. ليست هناك حاجة لتنقية الأجسام المضادة باستخدام بروتين A / G حتى ثبت بوضوح أن هناك نشاطية عبر الكبيرة التي ELISA والنشاف الغربي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl