Production de Nurr-1 anticorps polyclonaux spécifiques gratuit de réactivité croisée contre son étroite homologues, Nor1 et Nur77

Résumé

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Résumé

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Introduction

Le facteur de transcription Nurr1 et ses homologues (Nur77 et NOR1) appartiennent à la sous-famille des récepteurs nucléaires 4A (NR4A) ^1. Ils sont également des récepteurs orphelins parce que leurs ligands endogènes ne sont pas encore identifiés. Nurr1 a été cloné en 1992 et bien connu pour être exprimé dans le cerveau ^2, son rôle essentiel pour le développement et la maintenance des neurones dopaminergiques du mésencéphale a été révélé par des études de souris knockout ^3. En outre, son rôle important pour le maintien des neurones dopaminergiques du mésencéphale a récemment été démontré par une étude de knock-out conditionnel ^4. En raison de ces études montrent élégantes rôles critiques de NURR1 pour les neurones dopaminergiques du mésencéphale, de nombreuses études ultérieures ont essentiellement porté sur la neurones dopaminergiques du mésencéphale et le trouble neurodégénératif liés à la dopamine, la maladie de Parkinson (PD) ^5.

Notamment, Nurr1 est exprimée non seulement dans les dopamine mésencéphale (MDA) neurones, mais aussi dans les diles zones du cerveau verset ^2, suggérant que cela peut avoir des rôles fonctionnels dans de nombreux domaines non-Da, ce qui est fortement soutenue par des études plus récentes montrent que Nurr1 joue des rôles importants dans diverses fonctions du cerveau. Pour des exemples, il a été montré que les activités de mémoire induisant comme l'apprentissage, ou d'autres tâches de dépendante de l'hippocampe résultat dans la régulation de l'expression Nurr1 dans l'hippocampe ^6,7. En outre, abattre d'expression Nurr1 dans l'hippocampe était suffisante pour altérer la mémoire à long terme et / ou la plasticité synaptique ^8-11, suggérant fortement que Nurr1 joue divers rôles dans de nombreuses zones du cerveau. Ainsi, afin de mieux comprendre l'expression de type cellule-spécifique et subcellulaire de Nurr1, il est souhaitable d'utiliser des anticorps spécifiques de NURR1, qui ne présentent pas de réactivité croisée à ses homologues Nur77 ou NOR1. Ce document décrit un protocole pré-adsorption pour générer des anticorps spécifiques NURR1 et de présenter des données supplémentaires montrant sa spécificité.

Protocole

Remarque: La composition de toutes les solutions citées ci-dessous peut être trouvé dans le tableau Matériaux / Équipement.

1. Protéine A Colonne Antibody Purification

1. Equilibrer une colonne de protéine de spin et de tous les tampons nécessaires à la température ambiante pendant 15 minutes avant de commencer la procédure.
2. Diluer le sérum immun 1: 1 avec de l'IgG de la protéine A Binding Buffer. (5 ml de sérum est recommandé).
3. Tapoter doucement une colonne de protéine de spin sur la paillasse pour déloger toute résine qui peut être logé dans le capuchon. Retirez le couvercle supérieur et enclenchez doucement la fermeture de fond. Placer la colonne dans un tube collecteur de 15 ml et laisser la solution de stockage se vider.
4. Ajouter 5 ml de protéine A IgG Binding Buffer et laissez la solution se vider.
5. Appliquer le sérum immun dilué dans la colonne et recueillir l'écoulement. Pour de meilleurs résultats, ajouter un volume d'échantillon qui contient une concentration d'anticorps inférieure à 80% d'anticorps se liant à la capacit de la colonney.
6. Laver la colonne avec 15 ml de protéine A ou IgG Binding Buffer jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm est inférieur à 0,1.
7. Ajouter 100 pi de tampon de neutralisation à cinq tubes de prélèvement étiquetés.
8. Ajouter 5 ml de tampon d'élution d'IgG de la protéine A et la colonne recueillir fractions de 1 ml dans chacun des tubes contenant 100 pi de tampon de neutralisation.
9. Mesurer l'absorption de chaque fraction à 280 nm et des fractions piscine avec une absorbance supérieure à 0,5. Gardez les fractions regroupées sur la glace jusqu'à ce que prêt pour la dialyse.
10. Régénérer la colonne en ajoutant 8 ml d'IgG tampon d'élution et laissez la solution de circuler à travers la colonne.
11. Rincer la colonne avec une solution Binding Protein A jusqu'à ce que les IgG éluant pH revient à 7.4.
12. Stocker la colonne par addition de 5 ml de solution de stockage (azoture de sodium à 0,02% dans du PBS). Lorsque environ 3 ml restent dans la colonne, bouchon de fond et de sécuriser le capuchon supérieur. Rangez la colonne à 4 ° C.
13. Déterminer la longueur oun tube de dialyse f nécessaire selon les instructions du fabricant. Utilisation de 16 mm de diamètre de tube plat utiliser 5,47 cm de longueur de tube par ml de solution à dialyse. Couper le tube et rincer avec du PBS pH 7,4 pendant 15 à 30 min.
14. Pliez et coupez une extrémité du tube de dialyse, transférer l'IgG commun fractions contenant un tube de dialyse équilibrées dans PBS pH 7,4 et fermer l'autre extrémité.
15. Dialyser à température ambiante contre 200 volumes de PBS, pH 7,4 pendant 2 heures.
16. Changez le tampon de dialyse (PBS fraîche pH 7,4) et dialyse pendant 2 h à température ambiante.
17. Changez le tampon de dialyse (PBS fraîche pH 7,4) et dialyse pendant la nuit à 4 ° C.
18. Conserver la solution d'anticorps dialysée à 4 ° C jusqu'au moment de procéder à d'autres étapes de purification.
19. Évaluer la concentration d'anticorps en utilisant son absorption à 280 nm et le coefficient d'absorption molaire d'anticorps à 280 nm de 210 000 M ^-1 cm ^{-1 12.}

2. Couplage de protéines LBD de couplage Aminolink Résine

1. Préparer deux colonnes, l'une pour l'autre et Nor1 pour Nur77. Suivez le même protocole pour les deux protéines.
2. Décongeler la protéine à être couplé à la résine sur de la glace. Déterminer la concentration en protéine en utilisant le coefficient d'extinction molaire et son absorbance à 280 nm ^12.
   1. En variante, en utilisant un essai de détermination de protéine tel que le dosage de l'acide bicinchoninique ^13. Si la protéine est dissoute dans un tampon Dialyser ou tampon contenant une amine échange contre le tampon de couplage. Si la protéine est dans un tampon approprié (pas d'amines libres) diluer 4 fois en tampon de couplage.
3. Utiliser 2 ml de résine pour 2 mg de protéine. Toutes les étapes qui suivent sont fournies à résine de 2 ml dans une colonne de 10 ml. Jusqu'à 10 mg de protéine peut être lié par 1 ml de résine (2 ml de 1: une suspension).
4. Préparer une colonne de 10 ml d'une fritte en le poussant vers le bas et l'exécution du PBS pH 7,4 à travers elle. Cap til fond de la colonne et ajouter 2 ml de tampon de couplage.
5. Ajouter le volume désiré de suspension (4 ml d'obtenir 2 ml de résine) à la colonne, retirez le bouchon de fond et laisser le drain de la colonne. Rincer la colonne avec un total de 6 ml (volume 3) résine-lit de tampon de couplage et de laisser la colonne se vider. Après le tampon de couplage a drainé, remplacer le bouchon de fond.
6. Ajouter 2-4 ml de protéine en suspension dans de couplage de tampon à la colonne (conserver une partie aliquote de la solution de protéine afin d'évaluer l'efficacité de couplage par comparaison de la concentration en protéine de l'éluat de l'étape 2.11 en utilisant soit l'absorbance à 280 nm ou le dosage bicinchoninique) . Cap et à la fin sur l'extrémité mélanger pour avoir une solution homogène.
7. Peser un 1,8 ml microtube vide et passer à la hotte. Soigneusement transférer _NaCNBH3 (environ 0,05 g) dans le tube pré-pesé. Fermer le tube et peser le tube contenant _NaCNBH3. Ne pas ouvrir le tube extérieur de la hotte.
8. Sur la base du poids de_NaCNBH3 transféré dans le tube, préparer une solution 5 M par addition de 1 M de NaOH. Le poids moléculaire du _NaCNBH3 est 62,84 g donc 0,05 g est égal à (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 ^-4 mole) 7,96 x 10 ^-4 moles. Pour obtenir une solution add 5 M (7,96 x 10 ^-4 / 5) 159 pl de 1 M NaOH.
9. Mesurer le volume total de la réaction qui a le volume de résine en considération. Ajouter 10 pi de 5 M _NaCNBH3 par ml de réaction.
   1. Par exemple: pour un volume de réaction de 4 ml ajouter 40 pi de 5 M _NaCNBH3. Pour 1 ml de résine et 3 ml de protéine ajoutée, le volume total est de 4 ml.
10. Cap de la colonne et à la fin mélanger plus fin. Fixer la colonne sur un agitateur de tube et laisser la réaction continuer pendant une nuit à 4 ° C.
11. Dans la matinée, porter la colonne à la hotte chimique et soigneusement enlever le bouchon comme certains gaz peut s'être formée. Égoutter la colonne dans un tube propre et économiser l'éluat pour mesurer la protéine concentration en utilisant l'absorbance à 280 nm de ¹² procédé ou le dosage de l'acide bicinchoninique et le comparer avec la concentration de protéine de départ dans l'étape 2.6.
12. Laver la résine avec 4 ml de tampon de couplage et de laisser le drain de la colonne.

3. Blocage sites restants

1. Laver la résine avec 4 ml de tampon de trempe. Égoutter et remettre le bouchon en bas. Ajouter 2 ml de tampon de trempe et suspendre la résine.
2. Évaluer le volume total de réaction en mesurant le volume de la résine et le volume de tampon de trempe, puis ajouter 10 ul de 5 M _NaCNBH3 par ml de volume réactionnel.
3. Mélanger délicatement à la température ambiante pendant 30 min fin sur la fin. Après 30 minutes, amener la colonne dans la hotte. Retirez délicatement le haut, puis retirez le bouchon de fond et laisser l'évacuation de la colonne dans un tube de déchets.
4. Laver la colonne avec 5 volumes de résine de la solution de lavage. Surveiller les lavages de la présence de protéines résiduelles en mesurant la abso de l'éluatrbance à 280 nm. Protéines non couplées sont lavés par la forte concentration en sel.
5. Laver la résine avec 6 ml de PBS dégazé pH 7,4 contenant de l'azoture de sodium à 0,02%. Garder la colonne à 4 ° C jusqu'à utilisation.

4. Purification de l'anticorps spécifiques NURR1

1. Rincer la colonne couplé Nur77 LBD avec 10 ml de PBS pH 7,4 et laisser l'évacuation de la colonne. Boucher le bas de la colonne et placer la colonne couplé Nur77 LBD drainé dans un nouveau tube de 15 ml de collecte.
2. Ajouter 5 ml de la protéine A des anticorps anti-NURR1 purifiés, plafonner la colonne et le placer sur un rotateur à 4 ° C pendant 1 heure. Retirez les capuchons supérieurs et inférieurs et de recueillir l'écoulement à travers. Mettez de côté sur la glace jusqu'à ce que prêt à ajouter à la colonne couplé Nor1 LBD.
3. Rincer la colonne couplé Nor1 LBD avec 10 ml de PBS pH 7,4 et laisser l'évacuation de la colonne. Boucher le bas de la colonne et placer la colonne Nor1 LBD couplé à un tube de 15 ml de collecte.
4. Ajouter le flux à travers du coup Nur77 LBDcolonne conduite, plafonner la colonne et le placer sur un rotateur à 4 ° C pendant 1 heure. Retirez les capuchons supérieurs et inférieurs et de recueillir l'écoulement à travers.
5. Mesurer la concentration d'anticorps en mesurant l'absorbance à 280 nm.

Analyse des purifiée d'anticorps anti-Nurr1 à base d'ELISA 5.

1. Ajouter 100 ul de protéine (2,5 pg / ml) dans les puits d'une plaque à 96 puits. Si l'essai 3 protéines différentes, ajouter 100 ul de protéines 1 à godets A1 à H4, 100 pi de la protéine 2, à godets A5 à H8 et 100 pi de la protéine 3 à puits A9 à H12. Couvrir la plaque et incuber une nuit à 4 ° C.
2. Laver deux fois les puits revêtus avec 300 pi par puits de PBS pH 7,4 et ajouter 300 ul de tampon de blocage ELISA pour les antigènes des puits revêtus entiers et incuber 2 heures à température ambiante.
3. Bien que la plaque bloque préparer une dilution de départ désirée de l'anticorps purifié anti-Nurr1 (allant de 10 à 100 pg / ml) dans du tampon de blocage ELISA.
4. Après 2 h de blocage, remplacer le tampon de bloc ELISA avec 100 pi de tampon frais de bloc ELISA à tous les puits.
5. Ajouter 100 ul d'anticorps anti-Nurr1 purifié dilué dans tous les puits dans la ligne A. diluer en série les anticorps en transférant 100 ul de solution de la ligne A dans les puits de la rangée B suivie par le transfert de 100 pi de solution de la ligne B à la ligne C continue jusqu'à la ligne G. Après le mélange des solutions dans les puits dans la rangée G jeter le supplément de 100 pi. Wells dans la rangée H ne reçoivent les premiers 100 pi de tampon de blocage. Incuber à température ambiante pendant 1 heure.
6. Laver la plaque trois (3) fois avec 300 pi par puits de 0,05% de Tween 20 dans du PBS pH 7,4 et épongez la plaque pour éliminer le tampon de lavage en excès.
7. Ajouter 100 pi de la peroxydase de raifort (HRP) conjugué de chèvre anti-IgG de lapin dilué dans du tampon de bloc ELISA (1: 8000 dilution; la gamme typique est de 1: 5000 à 1: 25.000). Incuber à température ambiante pendant 1 heure.
8. Laver les e plaqueree (3) fois comme décrit en 5.6. Rincez tous les puits en les remplissant avec 300 pi d'eau déminéralisée. Éponger l'excès d'eau en inversant la plaque sur du papier absorbant.
9. Ajouter 100 ul de 3, 3 ', 5, 5' tétraméthylbenzidine (réchauffé à température ambiante) à tous les puits et incuber 15 à 30 min à l'obscurité à température ambiante.
10. Arrêter la réaction en ajoutant 50 ul de 2 NH ₂ SO _4.
11. Lire l'absorbance à 450 nm soustraction du fond à 650 nm.

Résultats

Une comparaison de colonne de protéine A purifiée d'anticorps spécifiques de NURR1 avec la protéine A des anticorps purifiés anti-NURR1 suivis par le passage à travers Nur77 LBD et Nor1 LBD colonnes est illustrée sur la figure 1. Comme on peut le constater, la protéine A purifiée anticorps Nurr1 montré une forte liaison à Nurr1 LBD. Toutefois, il a également montré une liaison significative à Nur77 LBD et Nor1 LBD. Lorsque la protéine d'anticorps A purifié NURR1 ont été encore ...

Discussion

Le succès de ce protocole repose sur la disponibilité de protéines pures pour la caractérisation des anticorps dirigés contre un membre spécifique de la famille de la protéine d'intérêt. Il n'y a aucune nécessité de purifier les anticorps à l'aide de protéine A / G jusqu'à ce qu'il soit clairement établi qu'il existe des réactivités croisées significatives par ELISA et Western blot.

Comme il est indiqué dans le texte, il est important d'éviter ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl