Bu yakın homologları, Nor1 ve Nur77 karşı çapraz-reaktivite Nurr-1 spesifik olan poliklonal antikorlar Free üretimi

Özet

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Özet

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Giriş

Transkripsiyon faktörü Nurr1 ve homologları (Nur77 ve Nor1), nükleer reseptör alt ailesi 4A (NR4A) ¹ aittir. Onların endojen ligandlar henüz tespit edilmemiş çünkü onlar da yetim reseptörler vardır. Nurr1 ilk olarak 1992 klonlandı ve bilinen, ancak beyin ^{2'de belirtildiği} üzere, geliştirme ve orta beyin dopamin nöronlarının bakımı için de önemli bir rolü nakavt fare çalışmaları ³ konuldu. Buna ek olarak, orta beyin dopamin nöronlarının bakım için çok önemli bir rol son şartlı bir nakavt çalışma ⁴ ile gösterilmiştir. Nedeniyle orta beyin dopamin nöronları için Nurr1 en kritik roller gösteren bu zarif çalışmalara, birçok sonraki çalışmalarda büyük ölçüde dopamin nöronları ve dopamin ile ilişkili nörodejeneratif bozukluk orta beyin odaklanmıştır, Parkinson hastalığı (PH) ^5.

Özellikle, Nurr1 orta beyin dopamin (MDA) nöronlarda, aynı zamanda di sadece ifade edilirşiddetle Nurr1 çeşitli beyin fonksiyonlarında önemli rol oynadığını gösteren daha yeni çalışmalar tarafından desteklenmektedir olmayan birçok DA alanlarda işlevsel rollere sahip olabileceğini düşündüren ayet beyin bölgelerinin ^2. Örnekler için, bu gibi öğrenme gibi bellek indükleyici aktiviteleri gösterilir, ya da diğer hipokampus bağımlı görevler yukarı regülasyonu hipokampus ^6,7 Nurr1 ifade ile sonuçlanır. Buna ek olarak, aşağı hipokampus Nurr1 ifade vurmak şiddetle Nurr1 birçok beyin bölgelerindeki çeşitli roller oynadığını düşündüren, uzun süreli hafızayı ve / veya sinaptik plastisite ^8-11 zarar için yeterli oldu. Bu nedenle, daha Nurr1 hücre-tipi-spesifik ve hücre içi ifade anlamak için, onun homologları ya da Nur77 Nor1 herhangi bir çapraz reaktivite sergilemez Nurr1 özgü antikorları kullanmak için tercih edilir. Bu kağıt özgüllüğü gösteren Nurr1 özgü antikorlar ve bu ek verileri oluşturmak için bir ön-adsorpsiyonu protokolü tarif eder.

Protokol

Not: Aşağıda belirtilen tüm çözümlerin kompozisyon Malzemeleri / Ekipman Tablo bulunabilir.

1. Protein A Sütun Antikor Arıtma

1. Bir protein A spin kolon ve önceki işleme başlamadan 15 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar gerekli tüm tamponları dengelenmesi.
2. Bağışıklık serumu 1 seyreltin: 1 Protein A IgG Bağlama Tamponu ile. (Serum 5 mi tavsiye edilir).
3. Yavaşça kapağı açılmış olabilecek reçineyi çıkarmak için bir proteine ​​tezgah üstünde bir spin kolon dokunun. Üst kapağı çıkarın ve yavaşça alt kapatma koparmak. 15 ml toplama tüpüne sütun yerleştirin ve depolama çözümü süzülmesini bekleyin.
4. Bağlama Tamponu Protein A IgG 5 ml ilave edilir ve çözelti, kurumasına izin verin.
5. Sütuna seyreltilmiş bağışıklık serumu uygulayın ve flow-through toplamak. En iyi sonuçlar için, sütunun antikor-bağlanma capacit% 80 daha az bir antikor konsantrasyonunu içeren bir örnek hacim eklemeky.
6. Bağlama Tamponu Protein A IgG, 15 ml ya da 280 nm'de absorbans aşağıdaki 0.1 kadar sütun yıkayın.
7. Beş etiketli toplama tüplerine Nötralizasyon Tamponu 100 ul ekleyin.
8. Protein A sütun IgG Elüsyon Tamponu 5 ml ilave edilir ve Nötralizasyon tampon 100 ul ihtiva eden tüplerin her biri, 1 ml'lik fraksiyonların toplanması.
9. 0.5'den daha büyük olan bir absorbans 280 nm ve havuz fraksiyonlar her fraksiyondan absorbansı ölçülür. Diyaliz için hazır olana kadar buz üzerinde Bir araya toplanan fraksiyonlar tutun.
10. IgG Elüsyon Tamponu 8 ml ekleyerek sütun yeniden oluşturun ve çözelti sütun üzerinden akmasına izin verir.
11. 7.4'e yıkama sıvısı, pH dönene kadar Protein A IgG bağlanma solüsyonu ile sütun durulayın.
12. Depolama çözeltisi 5 ml (PBS içinde% 0.02 sodyum azid) eklenerek sütun saklayın. Yaklaşık 3 ml sütun, kapak altındaki kalır ve üst kapağı emniyete zaman. 4 ° C 'de sütun saklayın.
13. Uzunluk o belirleyinf Diyaliz tübü, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerekli. 16 mm, düz çaplı boru çözeltinin ml'si başına boru uzunluğunun 5.47 cm kullanımı kullanılarak diyaliz edilmesi. Boru kesme ve 15-30 dakika boyunca PBS pH 7.4 ile yıkayın.
14. Katlama ve diyaliz hortumun bir ucunu klip, PBS pH 7.4 içinde dengelenmiş diyaliz tüp içeren fraksiyonlar bir araya toplanmış IgG aktarmak ve diğer ucu kapatın.
15. 2 saat süre ile, PBS, pH 7.4, 200 hacmine karşı oda sıcaklığında Dialyze.
16. Diyaliz tamponu (taze PBS pH 7.4) değiştirin ve oda sıcaklığında başka bir 2 saat boyunca diyaliz.
17. Diyaliz tamponu (taze PBS pH 7.4) değiştirin ve 4 ° C'de gece boyunca diyaliz.
18. Daha fazla saflaştırma adımları ile devam etmek için hazır olana kadar 4 ° C'de diyaliz edilir antikor çözüm tutun.
19. 280 nm'de absorbans kullanılarak antikor konsantrasyonuna ve 210,000 ^{M-1 cm-1 12} ve 280 nm 'de antikor Molar soğurma katsayısı değerlendirin.

LBD Proteinlerin 2. Bağlantı Bağlantı Reçine AminoLink için

1. Iki sütun, Nor1 diğeri Nur77 diğer hazırlayın. Her iki protein için de aynı protokol takip edin.
2. Protein çözülme buz üzerinde reçineye bağlanmak üzere. Onun moler sönüm katsayısı ve 280 mil ^12, emiciliğinin kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
   1. Alternatif olarak, bu bisinkoninik asit yöntemi ¹³ gibi bir protein tayini testi kullanılır. Protein bağlama tamponuna karşı bir amin-içeren tampon diyaliz ya da tampon alışverişi içinde eritildi edin. Protein, Uygun bir tampon maddesi içinde (serbest aminler) ise bu, bağlayıcı tampon içinde 4 kat seyreltilir.
3. Protein 2 mg reçine 2 ml kullanın. Izleyen tüm adımlar 10 mi sütununda 2 mi reçine içindir. Protein 10 mg kadar reçine, 1 ml (1: bulamacın 1 2 ml) başına bağlanabilir.
4. Altına bir cam hamuru bastırıyor ve içinden PBS pH 7.4 çalıştırarak bir 10 ml sütun hazırlayın. Cap tO kolonun alt ve Kaplin Tampon 2 ml ekleyin.
5. , Kolona (reçine 2 ml elde etmek için 4 ml) çamurun istenen hacim ekleme alt kapağı çıkarın ve sütun drenaj sağlar. Bağlayıcı tampon içinde 6 ml (3 reçine yatak hacmi) 'in bir toplam sütun durulayın ve sütun boşalmasını sağlar. Kavrama tampon süzüldükten sonra, alt kapağı değiştirin.
6. (280 nm'de emicilik ya bisinkoninik deneyi kullanarak adım 2.11 elüatın protein konsantrasyonu karşılaştırarak bağlanma verimliliğini değerlendirmek için protein çözeltisi bir kısım devam) kolonuna bağlayıcı tampon içinde süspansiyon haline getirilmiş protein, 2-4 ml ekleyin . Cap ve homojen bir çözüm var uca üzerine sonunu karıştırın.
7. Boş 1.8 ml'lik ependorf tüp tartılır ve davlumbaz taşımak. Dikkatli bir şekilde önceden tartılmış bir tüp içinde _NaCNBH3 (yaklaşık 0.05 g) aktarın. Tüp kapatılır ve _NaCNBH3 içeren tüp tartın. Kaput dışında tüp açmayın.
8. Ağırlığına göre_NaCNBH3, tüpüne aktarıldı, 1 M NaOH ilave edilerek 5 M bir solüsyon yapmak. _NaCNBH3 moleküler ağırlığı 62.84 gr, bu nedenle 0.05 g (0.05 / 62.84 = 7.96 x 10 ^-4 mol) 7.96 x 10 ^-4 mol eşit olmasıdır. 5 M solüsyonu (7.96 x 10 ^-4/5), 1 M NaOH ile 159 ul yapmak için.
9. Reaksiyonun toplam hacmi dikkate reçine hacmi alarak ölçün. Reaksiyonun, ml başına 5 M _NaCNBH3 10 ul ekle.
   1. Örnek: Bir 4 ml reaksiyon hacmi için 5 M _NaCNBH3 40 ul ekle. Reçine 1 ml ilave protein, 3 ml için, toplam hacim 4 ml'dir.
10. Sütun Cap ve sonunda üzerinde sonunu karıştırın. Bir tüp döndürücü sütun Güvenli ve reaksiyon 4 ° C'de gece boyunca devam edelim.
11. Sabah, kimyasal kaput sütun getirmek ve dikkatli bir gaz oluşmuş olabilir gibi kapağı çıkarın. Temiz bir tüp içine sütun boşaltın ve protein con ölçmek için eluatı kaydetmek280 nm yöntemiyle ¹² absorbans veya bisinkoninik asit deneyi ve adım 2.6 başlayarak protein konsantrasyonu ile karşılaştırmak kullanarak santrasyonu.
12. Kavrama 4 ml tampon ile reçinenin yıkanır ve sütun süzdürülür.

3. Engelleme Kalan Siteler

1. Tampon söndürülmesi 4 ml reçine yıkanır. Drenaj ve alt kapağını kapatın. Tampon söndürülmesi 2 ml ekleyin ve reçine askıya.
2. Reçine hacmi ve söndürme tampon hacmi daha sonra reaksiyon hacmi ml başına 5 M _NaCNBH3 10 ul ekleyin ölçerek toplam reaksiyon hacmi değerlendirin.
3. 30 dakika ucu-üzerinde-sonu boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın. 30 dakika sonra, davlumbaz sütun getir. Dikkatle üst kaldırmak ve daha sonra alt kapağı çıkarın ve bir atık tüp içine sütun tahliye edelim.
4. Yıkama çözeltisi 5 reçine hacimleri ile sütun yıkayın. Taşıma ürününden en abso ölçülmesiyle bakiye proteinlerinin varlığı için yıkama Monitör280 nm'de rbance. Kuplajsız proteinler yüksek tuz konsantrasyonu ile yıkanır.
5. Gazı alınmış, PBS, pH 7.4,% 0.02 sodyum azid, 6 ml reçine yıkanır. Gerekli olana kadar, 4 ° C 'de sütun tutun.

Nurr1 Özgü Antikorlar 4. saflaştırılması

1. PBS pH 7.4 10 ml Nur77 LBD bağlanmış sütun durulayın ve sütun süzdürülür. Sütunun alt Cap ve yeni bir 15 ml toplama tüpü drene Nur77 LBD birleştiğinde sütun yerleştirin.
2. Protein 5 ml saflaştırılmış bir anti-Nurr1 antikor ekleyin 1 saat boyunca 4 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde sütun ve yer kap. Üst ve alt kapaklarını çıkarın ve akışı toplamak. Nor1 LBD birleştiğinde sütuna eklemek için hazır olana kadar buz üzerinde bir kenara koyun.
3. PBS pH 7.4 10 ml Nor1 LBD bağlanmış sütun durulayın ve sütun süzdürülür. Sütunun alt kapağı ve bir 15 ml'lik bir toplama tüpü içinde Nor1 LBD bağlanmış sütun yerleştirin.
4. Nur77 LBD darbeden akışını yoluyla Ekleyol kolon, 1 saat boyunca 4 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde sütun ve yer kap. Üst ve alt kapaklarını çıkarın ve akışı toplamak.
5. 280 nm'de absorbans ölçümü ile antikor konsantrasyonu ölçümü.

Saf Anti-Nurr1 Antikor 5. ELISA-tabanlı Analiz

1. 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına protein, 100 ul (2.5 ug / ml) ilave et. 3 farklı protein test için, H4 Wells A1, H8 Wells A5 proteinin 2, 100 ul, ve H12 kuyu A9 proteinin 3 100 ul proteinin 1. 100 ul ilave edin. Plaka Kapak ve 4 ° C'de bir gece inkübe edin.
2. PBS pH 7.4, oyuk başına 300 ul iki kez kaplanmış oyuklarına yıkayın ve tüm antijen kaplı oyuklara ELISA Bloke edici tamponun 300 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe et.
3. Plakası saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorun arzu edilen çıkış seyreltme hazırlanması bloke edilirken ELISA bloke tamponu içinde (10 ile 100 ug / ml arasında değişen).
4. Engelleme 2 saat sonra, tüm oyuklara taze ELISA blok tamponunda 100 ul ELISA blok tamponu değiştirin.
5. Seri olarak C satır satır B çözeltisinin 100 ul aktarma ardından satır B çukurlara satır A çözeltisi 100 ul aktarma ile antikorları seyreltik satır A'da tüm oyuklara seyreltildi saflaştırılmış anti-Nurr1 antikoru 100 ul ekle aşağı doğru devam G ekstra 100 ul atmak aralıksız kuyularda çözüm karıştırıldıktan sonra G. satır. Satır H Wells, sadece tampon engelleme ilk 100 ul alırsınız. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
6. PBS pH 7.4 plaka,% 0,05 Tween 20, oyuk başına 300 ul olan üç (3) defa yıkayın ve fazla yıkama tamponu çıkması için plakayı blot.
7. Yaban turpu peroksidazı (HRP), ELISA Blok tamponu içinde seyreltilmiş biyotinle konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG, 100 ul ekle (1: 8000 seyreltme, tipik bir aralığı, 1: 25,000: 5,000 ile 1 arası). 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
8. Plaka th yıkayınREE (3) defa 5.6 de tarif edildiği gibi. Iyonu giderilmiş su, 300 ul ile doldurarak her kuyu durulayın. Emici kağıt üzerine plakayı baş aşağı çevirerek fazla suyu kurulayın.
9. Tüm oyuklara tetrametilbenzidin (oda sıcaklığına kadar ılıtıldı) 3 100 ul, 3 '5, 5', ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 karanlıkta 30 dakika için inkübe edilir.
10. SO _{4 NH2} 2 50 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun.
11. 650 nm 'de bir arka plan çıkarılması 450 nm'de absorbansı okumak.

Sonuçlar

Protein bir karşılaştırması Nur77 LBD ve Nor1 LBD sütunları boyunca geçirilerek ve ardından bir saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorları görülebilir Şekil 1. As gösterilmiştir, Protein A sütun saf hale Nurr1-spesifik antikorlar, protein-A saf hale Nurr1 antikor güçlü bir bağlanma sergilemiştir Nurr1 LBD'sine. Bununla birlikte, aynı zamanda Nur77 LBD ve Nor1 LBD bağlanmasını belirgin göstermiştir. Protein A saflaştırılmış Nurr1 antikorlar ayrıca Nur77 LBD ve Nor1 LB...

Tartışmalar

Bu protokolün bir başarı ilgili protein ailesinin belirli bir üye karşı üretilen antikorların karakterizasyonu için, saf proteinler mevcudiyetine dayanır. Bu açık bir şekilde ELISA ve Western blot analizi ile önemli çapraz reaktivite olduğu kurulana kadar protein A / G kullanılarak antikorları saflaştırmak için bir ihtiyaç vardır.

Metinde belirtildiği gibi, bu tür Tris ya da glisin gibi bir amin-ihtiva eden tampon maddesi içinde sütuna çapraz bağlanmış olduğu ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl