ייצור של Nurr-1 Polyclonal ספציפי נוגדנים חינם של צלב-תגובתיות נגד homologs לסוגרה, Nor1 וNur77

Summary

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Abstract

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Introduction

גורם שעתוק Nurr1 וhomologs שלה (Nur77 וNor1) שייכים ל4A קולט הגרעיני תת משפחה (NR4A) ^1. הם גם קולטנים יתום כי ligands אנדוגני אינו מזוהים עדיין. Nurr1 היה משובט ראשון בשנת 1992 ולמרות שידוע שבאו לידי ביטוי במוח ^2, תפקידה החיוני לפיתוח ותחזוקה של נוירונים דופמין המוח התיכון התגלה על ידי מחקרי עכבר נוקאאוט ^3. בנוסף, התפקיד החשוב שלה לצורך התחזוקה של נוירונים דופמין המוח התיכון הודגם לאחרונה על ידי מחקר בנוקאאוט מותנה ^4. בשל מחקרים האלגנטיים אלה מראים התפקידים הקריטיים של Nurr1 לנוירונים דופמין המוח התיכון, מחקרים רבים שלאחר מכן התמקדו במידה רבה בנוירונים דופאמין והפרעה ניוונית של מערכת עצבים הקשורים לדופמין המוח התיכון, מחלת פרקינסון (PD) ^5.

יש לציין, Nurr1 מתבטא לא רק בתאי עצב דופמין המוח התיכון (מד"א), אלא גם בdiאזורים במוח פסוק ^2, מה שמרמז שאולי יש לו תפקידים פונקציונליים בתחומים רבים שאינו התובע, אשר נתמך במידה רבה על ידי יותר מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי Nurr1 משחק תפקידים חשובים בתפקודי מוח שונים. לדוגמאות, זה הוצג פעילויות התרמה-זיכרון שכגון למידה, או משימות היפוקמפוס תלוי אחרות לגרום לעד-רגולציה של ביטוי Nurr1 ^ב6,7 היפוקמפוס. בנוסף, להפיל את ביטוי Nurr1 בהיפוקמפוס היה מספיק כדי לפגוע בזיכרון לטווח ארוך ו / או פלסטיות הסינפטית ^8-11, חזק המצביע על כך Nurr1 משחק תפקידים מגוונים באזורי מוח רבים. לכן, כדי להבין את ביטוי תאים מסוג ספציפי וsubcellular של Nurr1 נוסף, רצוי להשתמש נוגדני Nurr1 ספציפי, שאינו מפגינים כל תגובה צולבת לhomologs Nur77 או Nor1. מאמר זה מתאר פרוטוקול מראש ספיחה לייצר נוגדני Nurr1 ספציפי ונתונים נוספים מראים הנוכחיים הספציפי שלו.

Protocol

הערה: ניתן למצוא ההרכב של כל הפתרונות שהובאו להלן בטבלת חומרים / ציוד.

1. חלבון טור נוגדן טיהור

1. לאזן חלבון טור ספין וכל מאגרים הנדרשים לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות לפני תחילת ההליך.
2. לדלל את הסרום חיסוני 1: 1 עם החלבון IgG כריכת מאגר. (5 מיליליטר של סרום מומלץ).
3. לטפוח בעדינות חלבון טור ספין על גבי הספסל כדי לסלק כל שרף שעשוי להיות תקוע בפקק. הסר את המכסה העליון ועדינות להצמיד את הסגירה התחתונה. מניחים את הטור בצינור איסוף 15 מ"ל ולאפשר פתרון אחסון לניקוז.
4. הוסף 5 מיליליטר של החלבון IgG כריכת הצפת ולאפשר הפתרון לניקוז.
5. החל הסרום חיסוני המדולל לעמודה ולאסוף את הזרימה דרך. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להוסיף נפח דגימה המכיל ריכוז של נוגדנים פחות מ -80% מcapacit מחייב הנוגדן של העמודהy.
6. לשטוף את העמודה עם 15 מיליליטר של החלבון IgG כריכת הצפת או עד הספיגה ב 280 ננומטר היא מתחת 0.1.
7. להוסיף ניטרול הצפת 100 μl לחמישה צינורות אוסף שכותרתו.
8. הוסף 5 מיליליטר של IgG הצפת elution לחלבון עמודה ולאסוף שברי 1 מיליליטר בכל אחד מהצינורות המכילים ניטרול הצפת 100 μl.
9. מדוד את הספיגה של כל חלק ב280 ננומטר ברים ובריכה עם הספיגה גבוהה מ -0.5. שמור את השברים ונקווה על קרח עד מוכן לדיאליזה.
10. להתחדש העמודה על ידי הוספת 8 מיליליטר של IgG הצפת elution ולאפשר הפתרון לזרום דרך העמודה.
11. יש לשטוף את הטור עם פתרון כריכת החלבון IgG עד תשואות pH eluent 7.4.
12. אחסן את העמודה על ידי הוספת 5 מיליליטר של פתרון אחסון (0.02% אזיד הנתרן PBS). כאשר 3 מיליליטר כ יישאר בעמודה, התחתונה הכובע ולאבטח את המכסה העליון. אחסן את הטור ב 4 מעלות צלזיוס.
13. לקבוע את אורך oצורך צינורות דיאליזה ו בהתאם להוראות היצרן. שימוש בצינורות בקוטר 16 מ"מ שטוח להשתמש 5.47 סנטימטר של אורך צינור לכל מיליליטר של פתרון לדיאליזה. חותך את צינורות ולשטוף עם pH 7.4 PBS במשך 15 עד 30 דקות.
14. מקפלים וקליפ קצה אחד של צינור הדיאליזה, להעביר IgG נקווה שמכיל שברים לצינורות דיאליזה equilibrated בpH 7.4 PBS ולסגור את הקצה השני.
15. Dialyze בטמפרטורת חדר נגד 200 כרכים של pH 7.4 PBS עבור שעה 2.
16. לשנות את חיץ הדיאליזה (PBS pH הטרי 7.4) ודיאליזה לעוד 2 שעות בטמפרטורת חדר.
17. לשנות את חיץ הדיאליזה (PBS pH הטרי 7.4) ודיאליזת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
18. שמור את פתרון נוגדן dialyzed על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך בצעדי טיהור נוספים.
19. להעריך את ריכוז הנוגדנים באמצעות הספיגה שלה ב 280 ננומטר ומקדם ספיגה הטוחנות של נוגדנים ב 280 ננומטר של 210,000 M ^-1 סנטימטר ^{-1 12.}

2. צימוד של החלבונים LBD לAminoLink צימוד שרף

1. הכן שתי עמודות, אחת לNor1 ואחר לNur77. בצע את אותו הפרוטוקול לשני החלבונים.
2. להפשיר את החלבון שמצמיד את השרף על קרח. קבע את ריכוז החלבון באמצעות מקדמה טוחנת הכחדה והספיגה שלה ב 280 ננומטר ^12.
   1. לחלופין, להשתמש assay נחישות חלבון כגון assay חומצת bicinchoninic ^13. אם החלבון הוא מומס בחילופי dialyze חיץ המכיל אמין או חיץ נגד הצפת זיווגים. אם החלבון הוא בחיץ מתאים (לא אמינים חינם) לדלל אותו פי 4 בצימוד מאגר.
3. השתמש 2 מיליליטר של שרף עבור 2 מ"ג של חלבון. כל השלבים הבאים הם עבור שרף 2 מיליליטר בעמודת 10 מיליליטר. עד 10 מ"ג של חלבון יכול להיות מקושר לכל 1 מיליליטר של שרף (2 מיליליטר של 1: 1 תרחיף).
4. הכן עמודת 10 מיליליטר על ידי לחיצת frit לתחתית ופועל PBS pH 7.4 דרכו. כובע לאהוא חלק תחתון של העמודה ולהוסיף 2 מיליליטר של צימוד מאגר.
5. הוסף את הנפח הרצוי של תרחיף (4 מיליליטר להשיג 2 מיליליטר של שרף) לעמודה, להסיר את הכובע התחתון ולתת לטמיון הטור. יש לשטוף את העמודה עם סך של 6 מיליליטר (3 שרף-מיטת נפח) של צימוד מאגר ולאפשר לטור לניקוז. לאחר חיץ הצימוד נקז, להחליף את הכובע התחתון.
6. להוסיף 2-4 מיליליטר של החלבון התלוי בצימוד מאגר לעמודה (לשמור aliquot של פתרון החלבון כדי להעריך את יעילות הצימוד על ידי השוואת ריכוז החלבון של eluate בשלב 2.11 או באמצעות הספיגה ב 280 ננומטר או assay bicinchoninic) . כובע ולערבב סוף על הסוף יש פתרון הומוגני.
7. שוקל צינור microcentrifuge 1.8 מיליליטר ריק ולעבור למנדף. להעביר NaCNBH ₃ (על 0.05 ז) בזהירות בצינור-שקל מראש. סגור את הצינור ולשקול את הצינור המכיל NaCNBH _3. אל תפתחו את הצינור מחוץ למכסת המנוע.
8. בהתבסס על המשקל שלNaCNBH ₃ הועבר לתוך הצינור, להפוך את פתרון 5 M על ידי הוספת 1 ​​M NaOH. המשקל המולקולרי של NaCNBH ₃ הוא 62.84 גרם לכן 0.05 גרם שווה (0.05 / 62.84 = 7.96 x 10 ^-4 שומות) 7.96 x 10 ^-4 שומות. כדי להפוך 5 M להוסיף פתרון (7.96 x 10 ^-4 / 5) 159 μl של 1 M NaOH.
9. למדוד הנפח הכולל של התגובה לוקח את שרף הנפח בחשבון. הוסף 10 μl 5 M NaCNBH ₃ לכל מיליליטר של תגובה.
   1. לדוגמא: עבור 4 מיליליטר נפח תגובה להוסיף 40 μl 5 M NaCNBH _3. ל1 מיליליטר של שרף ושל 3 מיליליטר חלבון הוסיף, הנפח הכולל הוא 4 מיליליטר.
10. מכסה את הטור ולערבב סוף על הסוף. אבטח את הטור על הכתף צינור ולתת את התגובה להמשיך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
11. בבוקר, להביא את הטור למכסת המנוע הכימי ובזהירות להסיר את הכובע כמו כמה גז ייתכן שנוצר. מסננים את העמודה לתוך צינור נקי ולשמור eluate למדוד את קון החלבוןcentration באמצעות הספיגה ב שיטת ננומטר 280 ¹² או assay חומצת bicinchoninic ולהשוות אותו עם ריכוז החלבון מתחיל בצעד 2.6.
12. לשטוף את השרף עם 4 מיליליטר של צימוד הצפת ולתת לטמיון הטור.

3. אתרי חסימה נותרה

1. לשטוף את השרף עם 4 מיליליטר של חיץ מרווה. מסננים ולהחליף את הכובע התחתון. הוסף 2 מיליליטר של חיץ מרווה ולהשעות את השרף.
2. להעריך את סך נפח תגובה על ידי מדידת נפח השרף ומרווית חיץ הנפח ולאחר מכן להוסיף 10 μl 5 M NaCNBH ₃ לכל מיליליטר של נפח תגובה.
3. מערבבים בעדינות בטמפרטורת חדר למשך 30 סוף-על-קצה דק '. לאחר 30 דקות, להביא את הטור במנדף. מוציא בזהירות את החלק העליון ולאחר מכן להסיר את הכובע התחתון ולתת לטמיון העמודה לתוך צינור פסולת.
4. לשטוף את העמודה עם 5 כרכי שרף של פתרון לשטוף. צג שוטף לנוכחות של חלבונים שיורית על ידי מדידת abso של eluaterbance ב 280 ננומטר. חלבוני נחק נשטפים החוצה על ידי ריכוז מלח הגבוה.
5. לשטוף את השרף עם 6 מיליליטר של 7.4 אזיד degassed PBS pH מכיל 0.02% נתרן. שמור את הטור על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.

4. טיהור של נוגדנים ספציפיים Nurr1

1. יש לשטוף את הטור בשילוב Nur77 LBD עם 10 מיליליטר של PBS pH 7.4 ולתת לטמיון הטור. מכסה את החלק התחתון של העמודה ולמקם את טור Nur77 LBD סחוט בשילוב בצינור איסוף 15 מיליליטר חדש.
2. הוסף 5 מיליליטר של חלבון נוגדנים נגד Nurr1 מטוהרים, מכסה את הטור ומקום על הכתף ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הסר את המכסים העליונים ותחתונים ולאסוף את הזרימה דרך. מניח בצד על קרח עד מוכן להוסיף לעמודה בשילוב Nor1 LBD.
3. יש לשטוף את הטור בשילוב Nor1 LBD עם 10 מיליליטר של PBS pH 7.4 ולתת לטמיון הטור. מכסה את החלק התחתון של העמודה ולמקם את LBD Nor1 טור בשילוב בצינור איסוף 15 מיליליטר.
4. הוסף את הזרימה דרך מהפיכת Nur77 LBDטור הוביל, מכסה את הטור ומקום על הכתף על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הסר את המכסים העליונים ותחתונים ולאסוף את הזרימה דרך.
5. למדוד את ריכוז נוגדנים על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר.

ניתוח של מזוקקים אנטי-Nurr1 נוגדנים מבוסס ELISA 5.

1. להוסיף חלבון 100 μl (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) לבארות של צלחת גם 96. אם בודק 3 חלבונים שונים, להוסיף חלבון 1 100 μl לA1 בארות לH4, של חלבון 2 100 μl, לA5 בארות לH8 ושל חלבון 3 100 μl לA9 בארות לH12. מכסה את הצלחת ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.
2. לשטוף את הבארות מצופים פעמיים עם 300 μl לכל גם של PBS pH 7.4 ולהוסיף 300 μl של חיץ חסימת ELISA לבארות אנטיגן כל מצופות דגירה 2 שעות בטמפרטורת חדר.
3. בעוד הצלחת חוסמת להכין רצוי דילול החל מנוגדן אנטי Nurr1 מטוהר (החל 10-100 מיקרוגרם / מיליליטר) במאגר חסימת ELISA.
4. לאחר 2 שעות של חסימה, להחליף את חיץ בלוק ELISA עם של חיץ לחסום ELISA טרי 100 μl לכל הבארות.
5. הוסף לדילול נוגדן אנטי Nurr1 מטוהר 100 μl לכל הבארות בא השורה סדרו לדלל את הנוגדנים על ידי העברה של פתרון 100 μl משורה לבארות בשורת B ואחרי העברה של פתרון 100 μl מהשורה B לחתור C ממשיך עד לשורה ג 'לאחר ערבוב הפתרונות בבארות בשורת G להשליך 100 μl הנוסף. ולס בשורת H לקבל רק של חיץ חסימת 100 μl הראשוני. דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
6. לשטוף את הצלחת שלוש (3) פעמים עם 300 μl לכל גם של 0.05% Tween 20 בPBS pH 7.4 ולמחוק את הצלחת כדי להסיר חיץ לשטוף עודף.
7. הוסף לסוסי צנון Peroxidase (HRP) IgG נגד הארנב עיזים מצומדות מדולל במאגר בלוק ELISA 100 μl (1: 8,000 דילול; מגוון הטיפוסי הוא בין 1: 5000 עד 1: 25,000). דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
8. שטוף את ה הצלחתרי (3) פעמים כמתואר ב5.6. יש לשטוף את כל הבארות על ידי מילוי אותם עם 300 μl מים ללא יונים. כתם מים עודפים על ידי היפוך לצלחת על נייר סופג.
9. להוסיף 3 100 μl, 3 ', 5, 5' tetramethylbenzidine (חימם לטמפרטורת חדר) לכל בארות דגירה 15 עד 30 דקות בחושך בטמפרטורת חדר.
10. לעצור את התגובה על ידי הוספת 50 μl של 2 NH ₂ SO _4.
11. קראו הספיגה ב 450 ננומטר הפחתת רקע ב 650 ננומטר.

תוצאות

השוואה של חלבון נוגדני Nurr1 ספציפי עמודה מטוהרת עם חלבון נוגדנים נגד Nurr1 מטוהרים ואחרי המעבר בNur77 LBD וNor1 LBD עמודות מוצגים באיור 1. כפי שניתן לראות, מטוהר נוגדן Nurr1 חלבון הציגה חזק מחייבת לNurr1 LBD. עם זאת, הוא גם הוכיח משמעותי מחייב Nur77 LBD וNor1 LBD. כאשר נוגדני Nurr1-מטוהר ח?...

Discussion

ההצלחה של פרוטוקול זה מסתמכת על הזמינות של חלבונים טהורים לאפיון הנוגדנים שהועלו נגד חבר ספציפי של משפחת החלבון של עניין. אין צורך לטהר את הנוגדנים באמצעות חלבון / G עד שברור נקבע כי יש reactivities הצולב משמעותי על ידי ELISA ומערבי סופג.

כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl