Produzione di Nurr-1 specifici anticorpi policlonali gratuito di cross-reattività contro i suoi omologhi, Chiudi Nor1 e Nur77

Riepilogo

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Abstract

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Introduzione

Il fattore di trascrizione Nurr1 e suoi omologhi (Nur77 e Nor1) appartengono al recettore nucleare sottofamiglia 4A (NR4A) ^1. Essi sono anche i recettori orfani perché i loro ligandi endogeni non sono ancora identificati. Nurr1 è stato clonato nel 1992 e, anche se si sa essere espressa nel cervello ^2, il suo ruolo essenziale per lo sviluppo e la manutenzione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo è stato rivelato da studi sui topi knockout ^3. Inoltre, il suo ruolo importante per il mantenimento dei neuroni dopaminergici del mesencefalo è stato recentemente dimostrato da uno studio KO condizionale ^4. A causa di queste eleganti studi che dimostrano ruoli critici di Nurr1 per i neuroni dopaminergici del mesencefalo, molti studi successivi hanno in gran parte concentrati sul mesencefalo neuroni dopaminergici e malattia neurodegenerativa, la dopamina legati, il morbo di Parkinson (PD) ^5.

In particolare, Nurr1 è espresso non solo nelle dopamina mesencefalo (MDA) neuroni, ma anche in diaree cerebrali versetto ^2, suggerendo che essa può avere ruoli funzionali in molti settori non-DA, che è fortemente supportati da studi più recenti mostrano che Nurr1 svolge un ruolo importante in varie funzioni cerebrali. Per alcuni esempi, è stato dimostrato che le attività di memoria che inducono come l'apprendimento, o di altri compiti ippocampo-dipendente risultano in up-regolazione dell'espressione Nurr1 nell'ippocampo ^6,7. Inoltre, abbattere di espressione Nurr1 nell'ippocampo era sufficiente a ridurre la memoria a lungo termine e / o di plasticità sinaptica ^8-11, fortemente suggerendo che Nurr1 svolge diversi ruoli in molte aree del cervello. Così, per capire meglio l'espressione di cellule di tipo specifico e subcellulare di Nurr1, è auspicabile utilizzare anticorpi specifici Nurr1, che non presentano alcuna cross-reattività ai suoi omologhi Nur77 o Nor1. Questo documento descrive un protocollo di pre-adsorbimento per generare anticorpi specifici Nurr1 e presentare dati aggiuntivi che mostrano la sua specificità.

Protocollo

Nota: la composizione di tutte le soluzioni citate di seguito può essere trovato nella Tabella Materiali / attrezzature.

1. Proteina A Colonna anticorpi Purificazione

1. Equilibrare una proteina A Spin Column e tutti i buffer necessari a temperatura ambiente per 15 minuti prima di iniziare la procedura.
2. Diluire il siero immune 1: 1 con Proteina A IgG Binding Buffer. (5 ml di siero è consigliato).
3. Battere delicatamente una proteina A Spin Column sul banco per rimuovere la resina che può essere presentato nel tappo. Togliere il tappo superiore e far scattare delicatamente la chiusura di fondo. Porre la colonna in un tubo di raccolta da 15 ml e lasciare soluzione di storage di scarico.
4. Aggiungere 5 ml di Proteina A IgG Binding Buffer e consentire la soluzione di scendere.
5. Applicare il siero immune diluito alla colonna e raccogliere il flow-through. Per ottenere i migliori risultati, aggiungere un volume di campione che contiene una concentrazione di anticorpi inferiore all'80% di anticorpo vincolante capacit della colonnaa.
6. Lavare la colonna con 15 ml di Proteina A IgG Binding Buffer o finché l'assorbanza a 280 nm è inferiore a 0,1.
7. Aggiungere 100 ml di neutralizzazione tampone a cinque tubi di raccolta etichettati.
8. Aggiungere 5 ml di IgG Elution Buffer alla colonna di Proteina A e raccogliere 1 ml frazioni ciascuna delle provette contenenti 100 ml di tampone di neutralizzazione.
9. Misurare l'assorbanza di ogni frazione a 280 nm frazioni e piscina con un'assorbanza maggiore di 0,5. Tenere le frazioni in pool sul ghiaccio fino al momento per la dialisi.
10. Rigenerare colonna aggiungendo 8 ml di IgG Elution Buffer e lasciare che la soluzione di fluire attraverso la colonna.
11. Lavare la colonna con la soluzione Binding Protein A IgG finché il pH dell'eluente ritorna 7.4.
12. Conservare la colonna aggiungendo 5 ml di soluzione di conservazione (0,02% di sodio azide in PBS). Quando circa 3 ml rimangono nella colonna, coperchio inferiore e fissare il tappo superiore. Conservare la colonna a 4 ° C.
13. Determinare la lunghezza otubo di dialisi f necessaria in base alle istruzioni del produttore. Utilizzando 16 millimetri tubo diametro piatti utilizzano 5,47 centimetri di lunghezza del tubo per ml di soluzione da dializzato. Tagliare il tubo e risciacquare con PBS pH 7,4 per 15 a 30 min.
14. Piegare e tagliare una estremità del tubo di dialisi, trasferire l'IgG pool contenente frazioni a tubo di dialisi equilibrati in PBS pH 7,4 e chiudere l'altra estremità.
15. Dializzare a temperatura ambiente contro 200 volumi di PBS pH 7,4 per 2 ore.
16. Cambiare il tampone di dialisi (fresca PBS pH 7.4) e dializza per altri 2 ore a temperatura ambiente.
17. Modificare il buffer di dialisi (PBS fresco pH 7,4) e dializza notte a 4 ° C.
18. Conservare la soluzione di anticorpi dializzata a 4 ° C fino al momento di procedere con ulteriori fasi di purificazione.
19. Valutare la concentrazione di anticorpi con il suo assorbimento a 280 nm e il coefficiente di assorbimento molare di anticorpi a 280 nm di 210.000 M ^-1 cm ^{-1 12.}

2. Accoppiamento di LBD proteine ​​per AminoLink Giunto in resina

1. Preparare due colonne, una per Nor1 e l'altro per Nur77. Seguite lo stesso protocollo per entrambe le proteine.
2. Scongelare la proteina da accoppiare alla resina su ghiaccio. Determinare la concentrazione di proteine ​​utilizzando il coefficiente di estinzione molare e la sua assorbanza a 280 nm ^12.
   1. In alternativa, utilizzare un saggio determinazione delle proteine, come l'acido bicinconinico test ^13. Se la proteina viene disciolta in un cambio-ammina contenente tampone Dializzare o tampone contro il tampone di accoppiamento. Se la proteina è in un tampone adatto (non ammine libere) diluire 4 volte in Coupling Buffer.
3. Utilizzare 2 ml di resina per 2 mg di proteina. Tutte le fasi che seguono sono per la resina 2 ml in una colonna di 10 ml. Fino a 10 mg di proteine ​​possono essere collegati per 1 ml di resina (2 ml di 1: 1 slurry).
4. Preparare una colonna 10 ml spingendo una fritta al fondo e funzionante PBS pH 7,4 attraverso di essa. Cap tha fondo della colonna e aggiungere 2 ml di Coupling Buffer.
5. Aggiungere il volume desiderato di slurry (4 ml per ottenere 2 ml di resina) per la colonna, rimuovere il tappo inferiore e far defluire colonna. Lavare la colonna con un totale di 6 ml (volume 3 resina-letto) di Coupling Buffer e che la colonna di scarico. Dopo il buffer di accoppiamento sia scolato, sostituire il tappo inferiore.
6. Aggiungere 2-4 ml di proteina sospese in Coupling Buffer alla colonna (mantenere una aliquota della soluzione proteica di valutare l'efficienza di accoppiamento confrontando la concentrazione proteica dell'eluato nel passo 2.11 utilizzando l'assorbanza a 280 nm o saggio bicinconinico) . Cap e mescolare fine su fine di avere una soluzione omogenea.
7. Pesare una provetta 1,8 ml vuoto e passare alla cappa aspirante. Trasferire accuratamente NaCNBH ₃ (circa 0,05 g) nel tubo pre-pesato. Chiudere la provetta e pesare la provetta contenente NaCNBH _3. Non aprire il tubo esterno della cappa.
8. Sulla base del pesoNaCNBH ₃ trasferito nel tubo, ottenere una soluzione 5 M aggiungendo 1 M NaOH. Il peso molecolare di NaCNBH ₃ è 62.84 g quindi 0,05 g è pari a (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 ^-4 moli) 7,96 x 10 ^-4 moli. Per fare una soluzione add 5 M (7.96 x 10 ^-4/5) 159 ml di 1 M NaOH.
9. Misurare il volume totale della reazione che il volume di resina in considerazione. Aggiungere 10 ml di 5 M NaCNBH ₃ per ml di reazione.
   1. Ad esempio: per un volume di reazione 4 ml aggiungere 40 ml di 5 M NaCNBH _3. Per 1 ml di resina e 3 ml di proteina aggiunta, il volume totale di 4 ml.
10. Chiudere la colonna e mescolare fine su fine. Fissare la colonna su un rotatore tubo e lasciare che la reazione continui notte a 4 ° C.
11. Al mattino, portare la colonna alla cappa chimica e con attenzione rimuovere il tappo alcuni gas potrebbe essersi formata. Scolate la colonna in una provetta pulita e salvare l'eluato per misurare l'aria di proteinecentrazione usando l'assorbanza a 280 nm Metodo ¹² o il dosaggio dell'acido bicinconinico e confrontarlo con la concentrazione della proteina di partenza al punto 2.6.
12. Lavare la resina con 4 ml di Coupling Buffer e lasciare che lo scarico della colonna.

3. Bloccare rimanente Siti

1. Lavare la resina con 4 ml di tampone di tempra. Scolare e sostituire il tappo inferiore. Aggiungere 2 ml di tampone di tempra e sospendere la resina.
2. Valutare il volume totale di reazione misurando il volume di resina e il volume tampone quenching quindi aggiungere 10 ml di 5 M NaCNBH ₃ per ml di volume di reazione.
3. Mescolare delicatamente a temperatura ambiente per 30 min end-over-end. Dopo 30 min, portare la colonna nella cappa. Rimuovere con attenzione la parte superiore e poi togliere il tappo inferiore e far defluire colonna in un tubo di scarico.
4. Lavare la colonna con 5 volumi in resina di soluzione di lavaggio. Monitorare i lavaggi per la presenza di proteine ​​residue misurando asso del eluatorbance a 280 nm. Proteine ​​disaccoppiato vengono lavati dalla alta concentrazione salina.
5. Lavare la resina con 6 ml di degasato PBS pH 7,4 contenente 0,02% di sodio azide. Mantenere la colonna a 4 ° C fino al momento dell'uso.

4. Purificazione di Nurr1 anticorpi specifici

1. Lavare la colonna accoppiata Nur77 LBD con 10 ml di PBS pH 7.4 e lasciare che la colonna di scarico. Chiudere la parte inferiore della colonna e posizionare il Nur77 LBD colonna accoppiato drenato in un nuovo tubo di raccolta 15 ml.
2. Aggiungere 5 ml di proteine ​​A anticorpi purificati anti-Nurr1, tappare la colonna e posto su un rotatore a 4 ° C per 1 ora. Rimuovere i tappi superiore e inferiore e raccogliere il flusso attraverso. Mettere da parte sul ghiaccio fino al momento di aggiungere alla colonna accoppiata Nor1 LBD.
3. Lavare la colonna accoppiata Nor1 LBD con 10 ml di PBS pH 7.4 e lasciare che la colonna di scarico. Chiudere la parte inferiore della colonna e posizionare il Nor1 LBD colonna accoppiato in un tubo di raccolta 15 ml.
4. Aggiungere il flusso attraverso dal colpo di Stato Nur77 LBDcolonna led, cap colonna e posto su un rotatore a 4 ° C per 1 ora. Rimuovere i tappi superiore e inferiore e raccogliere il flusso attraverso.
5. Misurare la concentrazione dell'anticorpo misurando l'assorbanza a 280 nm.

Analisi basata su ELISA 5. di purificata Anti-Nurr1 anticorpo

1. Aggiungere 100 ml di proteine ​​(2,5 mg / ml) per i pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Se il test 3 diverse proteine, aggiungere 100 ml di proteine ​​1 nei pozzetti A1 a H4, 100 microlitri di proteine ​​2, a pozzi A5 a H8 e 100 microlitri di proteine ​​3 a pozzi A9 a H12. Coprire la piastra e incubare una notte a 4 ° C.
2. Lavare i pozzetti due volte con 300 microlitri per pozzetto di PBS pH 7,4 e aggiungere 300 ml di tampone bloccante ELISA all'intero pozzetti rivestiti di antigene e incubare 2 ore a temperatura ambiente.
3. Mentre la piastra blocca preparare una diluizione iniziale desiderato di purificato anticorpo anti-Nurr1 (che vanno da 10 a 100 mg / ml) in tampone bloccante ELISA.
4. Dopo 2 ore di blocco, sostituire il buffer del blocco ELISA con 100 ml di fresco buffer di blocco ELISA a tutti i pozzetti.
5. Aggiungere 100 ml di diluito anticorpo anti-Nurr1 purificata per tutti i pozzi nella riga A. serialmente diluire gli anticorpi trasferendo 100 ml di soluzione da riga A ai pozzetti nella riga B seguita da trasferimento di 100 ml di soluzione da riga B alla riga C proseguendo verso il basso per remare G. Dopo la miscelazione delle soluzioni in pozzi in fila G scartare l'extra 100 ml. Wells nella riga H ricevono solo i primi 100 ml di tampone di bloccaggio. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
6. Lavare la piastra di tre (3) volte con 300 microlitri per pozzetto di 0,05% Tween 20 in PBS pH 7,4 e asciugare la piastra per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso.
7. Aggiungere 100 ml di perossidasi di rafano (HRP) IgG anti-coniglio di capra coniugato diluito in un tampone blocco ELISA (1: 8.000 diluizione; la gamma tipica è da 1: 5.000 a 1: 25.000). Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
8. Lavare le th piastraree (3) volte come descritto in 5.6. Lavare tutti i pozzetti da riempiendole con 300 ml di acqua deionizzata. Tamponare l'acqua in eccesso capovolgendo la piastra su carta assorbente.
9. Aggiungere 100 pl di 3, 3 ', 5, 5' tetrametilbenzidina (riscaldato a temperatura ambiente) a tutti i pozzetti e incubare 15 a 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
10. Arrestare la reazione aggiungendo 50 ml di 2 NH ₂ SO _4.
11. Leggere l'assorbanza a 450 nm sottraendo sfondo a 650 nm.

Risultati

Un confronto di proteine ​​una colonna purificato anticorpi specifici Nurr1 con proteina purificata a anticorpi anti-Nurr1 seguita da passaggio attraverso Nur77 LBD e Nor1 LBD colonne è mostrato in figura 1. Come si vede, proteina A-purificato anticorpi Nurr1 mostrato un forte legame di Nurr1 LBD. Tuttavia, ha anche mostrato significativo legame Nur77 LBD e Nor1 LBD. Quando gli anticorpi della proteina A-purificata Nurr1 sono stati ulteriormente purificati contro Nur77 LBD e Nor1 LBD, l'affinit...

Discussione

Il successo di questo protocollo si basa sulla disponibilità di proteine ​​pure per la caratterizzazione degli anticorpi sollevati contro un determinato membro della famiglia delle proteine ​​di interesse. Non vi è alcuna necessità di purificare gli anticorpi utilizzando proteina A / G finché non è chiaramente dimostrato che sussistono notevoli reazioni crociate di ELISA e Western blotting.

Come indicato nel testo, è importante evitare che sospende la proteina (s) di essere ret...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl