Производство Nurr-1 Удельная поликлональных антител Бесплатные перекрестной реактивности против своих Близкие гомологи, Nor1 и Nur77

Резюме

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Аннотация

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Введение

Транскрипционный фактор Nurr1 и его гомологов (Nur77 и Nor1) относятся к ядерной рецепторов подсемейства 4А (NR4A) ^1. Они также сироты рецепторы, потому что их эндогенные лиганды пока не определены. Nurr1 впервые клонировали в 1992 году, и, хотя, как известно, выражается в мозге ^2, его существенную роль для развития и поддержания среднего мозга нейронов допамина было выявлено в исследованиях нокаутом мыши ^3. Кроме того, его важная роль для поддержания среднего мозга нейронов допамина недавно была продемонстрирована в исследовании условного нокаута ^4. Из-за этих исследований, показывающих, элегантные решающую роль Nurr1 для среднего мозга нейронов допамина, многие последующие исследования в основном сосредоточены на среднем мозге нейроны допамина и допамина нейродегенеративных расстройств, болезни Паркинсона (БП) ^5.

Следует отметить, что Nurr1 выражается не только в нейронах среднего мозга допамина (МДА), но также и в диучастки мозга стих ^2, предполагая, что он может иметь функциональные роли во многих областях, не-DA, который сильно поддерживается более недавних исследований, показывающих, что Nurr1 играет важную роль в различных функций мозга. Для примера, было показано, что память вызывающие действия, такие как обучение, или другие гиппокамп-зависимые задачи приводит к повышающей регуляции экспрессии Nurr1 в гиппокампе ^6,7. Кроме того, сбить из Nurr1 выражения в гиппокампе было достаточно, чтобы нарушить долгосрочную память и / или синаптической пластичности ^8-11, сильно предполагая, что Nurr1 играет различные роли во многих областях головного мозга. Таким образом, для дальнейшего понимания типов клеток специфический и внутриклеточную экспрессию Nurr1, желательно использовать Nurr1-специфические антитела, которые не обладают какой-либо перекрестной реактивности с его гомологи или Nur77 Nor1. Эта статья описывает протокол предварительного адсорбции генерировать Nurr1-специфические антитела и представить дополнительные данные, показывающие, свою специфику.

протокол

Примечание: состав всех решений, приведенных ниже, можно найти в материалах / Оборудование таблице.

1. Белок Колонка антител Очистка

1. Равновесие белка в колонку отжима и все необходимые буферы до комнатной температуры в течение 15 мин до начала процедуры.
2. Развести иммунной сыворотки 1: 1 с белком IgG связывающем буфере. (5 мл сыворотки рекомендуется).
3. Аккуратно нажмите белка в колонку спин на скамейке верхней выбить любую смолу, которые могут быть поданы в крышке. Снимите верхнюю крышку, аккуратно откусив нижнюю закрытие. Поместите колонку в 15 мл пробирку и позволяют решение для хранения данных, чтобы слить.
4. Добавьте 5 мл белка в связывающем буфере IgG и позволяют решение процедить.
5. Применение разбавленного иммунную сыворотку на колонку и собирают проточные. Для получения наилучших результатов, добавьте объем образца, который содержит концентрацию антител меньше, чем 80% антител привязки наращиванием потенциалов колонныу.
6. Промыть колонку с 15 мл белка в связывающем буфере IgG или пока поглощение при 280 нм не превышает 0,1.
7. Добавить 100 мкл буфера нейтрализации пяти меченых сбора труб.
8. Добавляют 5 мл IgG элюции буфером с белком колонку и собирают 1 мл фракций в каждую из пробирок, содержащих по 100 мкл нейтрализующего буфера.
9. Измеряют поглощение каждой фракции при 280 нм и фракции бассейн с оптической плотности более 0,5. Держите объединенных фракций на льду до готовности в диализе.
10. Регенерация колонки добавлением 8 мл IgG элюции буфером и чтобы раствор пропускали через колонку.
11. Промыть колонку с раствором связывающего белка IgG до элюент рН возвращается к 7,4.
12. Хранить столбец путем добавления 5 мл раствора для хранения (0,02% азида натрия в PBS). Когда примерно 3 мл остаются в колонку, крышки нижней и закрепите верхнюю крышку. Хранить колонку при 4 ° С.
13. Определите длину Oе диализа необходимо в соответствии с инструкциями изготовителя. Использование 16 мм трубки диаметром плоским использовать 5,47 см длины трубки на мл раствора для диализу. Отрежьте трубы и промойте PBS рН 7,4 в течение 15 мин 30.
14. Сложите и клип один конец трубки для диализа, передача объединенных IgG, содержащий фракции в трубке для диализа, уравновешенную PBS, рН 7,4 и закрыть другой конец.
15. Диализировать при комнатной температуре против 200 объемов PBS, рН 7,4 в течение 2 часов.
16. Изменение буфера для диализа (свежий PBS рН 7,4) и диализ еще в течение 2 ч при комнатной температуре.
17. Изменение буфера для диализа (свежий PBS рН 7,4) и диализ в течение ночи при 4 ° С.
18. Держите диализированную раствор антител при 4 ° С до готовности приступить к дальнейшим стадиям очистки.
19. Оценка концентрации антител, используя свою оптическую плотность при 280 нм и молярного коэффициента поглощения антител при 280 нм 210,000 М ^-1 см ^{-1 12.}

2. Взаимодействие LBD белков AminoLink Соединительная Ресин

1. Подготовьте две колонки, одна для Nor1 и другой для Nur77. Выполните ту же протокол для обоих белков.
2. Разморозить белок с возможностью подключения к смоле на льду. Определить концентрацию белка, используя его молярный коэффициент экстинкции и его поглощение при 280 нм ^12.
   1. Кроме того, использовать определения белка анализа, такие как анализа бицинхониновой кислоты ^13. Если белок, растворяют в амин-содержащий буфер диализа или буферного обмена против буфера для связывания. Если белок не в подходящем буфере (нет свободных аминов) разбавить его 4 раза в буфере дл св зывани.
3. Использование 2 мл смолы в течение 2 мг белка. Все шаги, которые следуют за 2 мл смолы в колонку с 10 мл. До 10 мг белка могут быть соединены в 1 мл смолы (2 мл 1: 1) суспензии.
4. Подготовка колонки 10 мл, нажав фритты на дно и работает PBS, рН 7,4 через него. Кап тон снизу колонны и добавьте 2 мл буфера для связывания.
5. Добавить нужного объема суспензии (4 мл с получением 2 мл смолы) на колонке, снять нижнюю крышку и пусть утечку столбца. Промойте колонку с в общей сложности 6 мл (объем 3 смолы кровать) сцепления буфера и позволяют колонки для слива. После буфера Муфта стечет, заменить нижнюю крышку.
6. Добавить 2-4 мл белка, суспендированного в буфере дл св зывани в колонке (держать аликвоту раствора белка, чтобы оценить эффективность связывания сравнением концентрации белка в элюате на этапе 2.11 либо с помощью оптической плотности при 280 нм или бицинхониновой анализа) , Крышка и смешать конец над концом иметь однородный раствор.
7. Взвесьте пустую 1,8 мл микроцентрифужных трубку и перейти к вытяжным шкафом. Тщательно передачи NaCNBH ₃ (около 0,05 г) в предварительно взвешенную пробирку. Закройте трубку и взвесить пробирку NaCNBH _3. Не открывайте трубку вне капотом.
8. На основании весаNaCNBH ₃ переносили в пробирки, сделать 5 М раствора добавлением 1 М NaOH. Молекулярная масса NaCNBH _3, 62.84 г, следовательно, 0,05 г равна (0,05 / 62,84 = 7,96 х 10 ^-4 моль) 7,96 х 10 ^-4 моль. Чтобы сделать 5 м раствору добавляют 7,96 (10 ^-4 / 5) 159 мкл 1 М NaOH.
9. Измерьте общий объем реакционной берет объем смолы во внимание. Добавьте 10 мкл 5 М NaCNBH ₃ на мл реакции.
   1. Например: реакционного объема 4 мл добавить 40 мкл 5 М NaCNBH _3. Для 1 мл смолы и 3 мл добавленного белка, общий объем 4 мл.
10. Крышка колонки и смешать конец над концом. Безопасный столбец на трубке ротатора и пусть реакцию продолжают в течение ночи при 4 ° С.
11. Утром довести колонну химической капотом и осторожно снимите крышку, как некоторое количество газа может быть сформирована. Слить колонку в чистую пробирку и сохранить элюата для измерения белка CONцентрация помощью оптической плотности при 280 нм методом ¹² или анализа бицинхониновой кислоты и сравнить его с концентрацией исходного белка в шаге 2.6.
12. Промыть смолу с 4 мл св зующего буфера и пусть утечку столбца.

3. Блокирование Оставшееся Сайты

1. Промыть смолу с 4 мл буфера закалки. Слейте и замените нижний колпачок. Добавить 2 мл буфера закалки и приостановить смолы.
2. Оценка Общий объем реакционной смеси путем измерения объема смолы и объем буфера закалки затем добавить 10 мкл 5 М NaCNBH ₃ на мл реакционного объема.
3. Тщательно перемешать при комнатной температуре в течение 30 мин в течение конечного конец. Через 30 мин, довести колонну в вытяжном шкафу. Осторожно снимите верхнюю, а затем снимите нижнюю крышку и пусть утечки столбца в сточных трубки.
4. Промывают колонку 5 объемов смолы промывочным раствором. Монитор промывок на наличие остаточных белков путем измерения абсо элюата вrbance при 280 нм. Несвязанных белков вымываются высокой концентрации соли.
5. Промыть смолу с 6 мл дегазированной PBS, рН 7,4, содержащем 0,02% азида натрия. Держите колонку при 4 ° С до тех пор, пока это необходимо.

4. Очистка Nurr1 специфических антител

1. Промыть колонку, соединенную Nur77 LBD с 10 мл PBS, рН 7,4, и пусть в канализацию столбца. Крышка нижней части колонны и поместите осушенных Nur77 LBD сочетании колонку в новом 15 мл пробирку.
2. Добавляют 5 мл очищенного белка антител Nurr1, крышка колонны и место на ротатор при 4 ° С в течение 1 часа. Снимите верхние и нижние крышки и собирать поток через. Отложите на льду до готовности добавить в сочетании колонке Nor1 LBD.
3. Промыть колонку, соединенную Nor1 LBD с 10 мл PBS, рН 7,4, и пусть в канализацию столбца. Крышка нижней части колонны и поместите Nor1 LBD сочетании столбец в 15 мл пробирку.
4. Добавить поток через от переворота Nur77 LBDпривело колонки, крышка колонны и место на ротатор при 4 ° С в течение 1 часа. Снимите верхние и нижние крышки и собирать поток через.
5. Измерение концентрации антител путем измерения оптической плотности при 280 нм.

5. ИФА на основе анализа очищенного Anti-Nurr1 антитела

1. Добавить 100 мкл белка (2,5 мкг / мл) в лунки 96-луночного планшета. Если тестирование 3 различных белков, добавьте 100 мкл белка 1 до скважин А1 до H4, 100 мкл белка 2, в лунки A5 в H8 и 100 мкл белка 3 Уэллсу A9 к Н12. Закройте планшет и инкубируют в течение ночи при 4 ° С.
2. Промыть лунок два раза по 300 мкл на лунку PBS, рН 7,4 и добавляют 300 мкл ELISA блокирующем буфере с целыми скважин, покрытых антигеном и инкубируют 2 часа при комнатной температуре.
3. В то время как пластина преграждает подготовить целевое исходное разведение очищенного анти-Nurr1 антитела (от 10 до 100 мкг / мл) в блокирующем буфере ELISA.
4. Через 2 ч блокировки, замените блок буфера ELISA с 100 мкл свежей ELISA блока буфера во все лунки.
5. Добавить 100 мкл разбавленного очищенной анти-Nurr1 антитела всех скважин в ряду А. Серийно разбавить антитела путем передачи 100 мкл раствора из ряда А в лунки в строке В последующей передачи 100 мкл раствора из ряда В грести C продолжая грести до G. После смешивания растворов в скважинах в строке G отбросить лишние 100 мкл. Уэллс в строке H получить только начальные 100 мкл блокирующего буфера. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
6. Промыть пластины три (3) раза по 300 мкл на лунку 0,05% Tween 20 в PBS, рН 7,4 и пятно на пластину, чтобы удалить избыток промывочного буфера.
7. Добавить 100 мкл пероксидазой хрена (HRP), конъюгированного козьего анти-кроличьего IgG, разбавленного в буфере блока ELISA (1: 8000 разведение; типичный диапазон составляет от 1: 5000 до 1: 25000). Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
8. Промыть пластины тысРЗЭ (3) раза, как описано в 5.6. Тщательно промойте все лунки, заполняя их с 300 мкл деионизированной воды. Промокните избыток воды опрокидыванием планшета на поглощающие бумаги.
9. Добавить 100 мкл 3, 3 ', 5, 5' тетраметилбензидином (нагревают до комнатной температуры) во все лунки и инкубируют 15 до 30 мин в темноте при комнатной температуре.
10. Остановить реакцию, добавив 50 мкл 2 H ₂ SO _4.
11. Измерить оптическую плотность при 450 нм вычитание фона при 650 нм.

Результаты

Сравнение белка колонку очищают Nurr1-специфические антитела с белком A очищенные антитела анти-Nurr1 затем прохождения через Nur77 ДТЛ и Nor1 LBD колонн, показанные на рисунке 1. Как видно, белок очищали Nurr1 антитела выставлены сильной связи чтобы Nurr1 ДТЛ. Тем не менее, он также показал зна...

Обсуждение

Успех этого протокола зависит от наличия чистых белков для характеризации антител, против конкретного члена семейства белков интереса. Там нет необходимости, чтобы очистить антител с использованием белка A / G, пока не будет четко установлено, что существуют значительные перекрестных ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl