Produktion von Nurr-1 spezifischen polyklonalen Antikörper Frei von Kreuzreaktivität gegen seine Close Homologe, Nor1 und Nur77

Zusammenfassung

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Zusammenfassung

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Einleitung

Der Transkriptionsfaktor Nurr1 und seinen Homologen (Nur77 und Nor1) gehören zu der Kernrezeptorfamilie 4A (NR4A) ^1. Sie sind auch Orphanrezeptoren weil ihre endogene Liganden noch nicht identifiziert. Nurr1 wurde erstmals 1992 kloniert, und obwohl bekannt ist, im Gehirn ² ausgedrückt werden, wurde ihre wesentliche Rolle für die Entwicklung und Wartung von Mittelhirnneuronen mit Dopamin-knockout Maus-Studien ³ offenbart. Außerdem wurde seine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Dopamin-Neuronen im Mittelhirn vor kurzem von einem Knockout-Studie ⁴ gezeigt. Aufgrund dieser eleganten Studien zeigen Nurr1 kritische Rollen für Dopamin-Neuronen im Mittelhirn, viele nachfolgende Untersuchungen weitgehend auf die Dopamin-Neuronen im Mittelhirn und Dopamin bezogene neurodegenerative Erkrankung konzentriert, Parkinson-Krankheit (PD) ^5.

Bemerkenswert ist, Nurr1 nicht nur in den Mittelhirn Dopamin (MDA) Neuronen, sondern auch in di ausgedrücktVers Gehirnbereichen ^2, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise funktionelle Rolle in vielen nicht-DA Bereichen, die stark durch neuere Studien zeigen, dass Nurr1 spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Hirnfunktionen unterstützt wird. Beispiele wurde wie Lern gezeigt, dass die Speicher-induzierende Aktivitäten oder andere Hippocampus abhängigen Aufgaben ergeben sich im Hochregulierung von Nurr1-Expression im Hippocampus ^6,7. Darüber hinaus nach unten von Nurr1-Expression im Hippocampus Klopf war ausreichend, um das Langzeitgedächtnis und / oder der synaptischen Plastizität ^8-11 beeinträchtigen, was stark darauf hinweist, daß Nurr1 spielt verschiedene Rollen in vielen Bereichen des Gehirns. Um somit die zelltypspezifisch und subzellulären Expression Nurr1 weiter zu verstehen, ist es wünschenswert, Nurr1-spezifische Antikörper, die keine Kreuzreaktivität gegenüber seinen Homologen oder Nur77 Nor1 nicht aufweisen, zu verwenden. Dieses Papier beschreibt eine Pre-Adsorption-Protokoll, um Nurr1-spezifische Antikörper vorhanden und zusätzliche Daten, die seine Spezifität zu erzeugen.

Protokoll

Hinweis: Die Zusammensetzung aller nachstehend genannten Lösungen können in der Werkstoffe / Zubehör Tabelle gefunden werden.

1. Protein A Säule Reinigung der Antikörper

1. Äquilibrieren ein Protein, eine Spin-Säule und alle benötigten Puffer auf Raumtemperatur 15 min vor dem Beginn des Verfahrens.
2. Verdünne das Immunserum 1: 1 mit Protein A IgG Bindungspuffer. (5 ml Serum wird empfohlen).
3. Klopfen Sie leicht ein Protein, eine Spin-Säule auf der Tischplatte, jede Harz, das in die Kappe eingelegt werden können, zu entfernen. Entfernen Sie die obere Kappe und sanft Snap aus dem Bodenverschluss. Legen Sie die Spalte in einem 15 ml-Collection-Tube und lassen Speicherlösung ablaufen.
4. 5 ml Protein A IgG Bindungspuffer und die Lösung ablaufen.
5. Übernehmen Sie die verdünnt Immunserum an die Säule und sammeln Sie die Durchströmung. Für beste Ergebnisse, einen Probenvolumen, das eine Antikörperkonzentration als 80% der Antikörper-bindenden capacit der Spalte enthält wenigery.
6. Mit 15 ml Protein A-IgG-Bindungspuffer oder bis die Absorption bei 280 nm unter 0,1 Die Säule.
7. 100 l Neutralization Buffer zu fünf markierten Sammelröhrchen.
8. 5 ml der IgG Elutionspuffer auf Protein A-Säule und Sammeln Fraktionen von 1 ml in jedes der Rohre mit den 100 ul Neutralisierungspuffer.
9. Die Extinktion jeder Fraktion bei 280 nm und Poolfraktionen mit einer Absorption von mehr als 0,5. Halten Sie die vereinigten Fraktionen auf Eis, bis sie zur Dialyse.
10. Regenerieren die Säule durch Zugabe von 8 ml IgG Elution Buffer und lassen Sie die Lösung durch die Säule fließen.
11. Spülen der Säule mit Protein A IgG Bindungslösung, bis die Laufmittel pH wieder auf 7,4.
12. Bewahren Sie die Spalte durch Zugabe von 5 ml-Speicherlösung (0,02% Natriumazid in PBS). Wenn etwa 3 ml bleiben in der Spalte, Kappenboden und befestigen Sie die obere Abdeckung. Bewahren Sie die Spalte bei 4 ° C.
13. Bestimmen Sie die Länge of Dialyseschlauch nach der Anleitung des Herstellers erforderlich ist. Unter Verwendung von 16 mm Flachrohrdurchmesser verwenden 5.47 cm Rohrlänge pro ml Lösung, um dialysiert werden. Schneiden Sie den Schlauch und Spülen mit PBS, pH 7,4, für 15 bis 30 min.
14. Falten und Clip ein Ende der Dialyseschlauch, überweisen Sie den gepoolten IgG enthaltenden Fraktionen in einen Dialyseschlauch in PBS pH 7,4 ins Gleichgewicht gebracht, und schließen Sie das andere Ende.
15. Dialyse bei Raumtemperatur gegen 200 Volumina PBS pH 7,4 für 2 Stunden.
16. Ändern die Dialysepuffer (frisch PBS pH 7,4) dialysiert und für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur.
17. Ändern Sie den Dialysepuffer (frisches PBS pH 7,4) dialysiert und über Nacht bei 4 ° C.
18. Halten Sie die dialysiert Antikörperlösung bei 4 ° C, bis bereit, mit weiteren Reinigungsschritten fortfahren.
19. Bewertung der Antikörperkonzentration unter Verwendung seiner Absorption bei 280 nm und der molare Absorptionskoeffizient von Antikörpern bei 280 nm von 210.000 M ^-1 cm ^{-1 12.}

2. Kupplung von LBD Proteine, um die Kopplung Resin Aminolink

1. Bereiten Sie zwei Spalten, eine für Nor1 und die andere für Nur77. Folgen Sie dem gleichen Protokoll sowohl Proteinen.
2. Aufzutauen, dass das Protein an das Harz auf Eis gekoppelt werden. Bestimmung der Proteinkonzentration unter Verwendung seines molaren Extinktionskoeffizienten und seine Absorption bei 280 nm ^12.
   1. Alternativ können Sie einen Proteinbestimmung Assay wie dem Bicinchoninsäure-Assay ^13. Wenn das Protein in einer aminhaltigen Puffer dialysiert oder Pufferaustausch gegen den Kopplungspuffer gelöst. Wenn das Protein in einem geeigneten Puffer (keine freien Amine) verdünnen 4fach in Kopplungspuffer.
3. Ein 2-ml Harz für 2 mg Protein. Alle Schritte, die folgen, beziehen sich auf 2 ml Harz in einem 10-ml-Säule. Bis zu 10 mg Protein pro 1 ml Harz (: 1 Aufschlämmung 2 ml 1) verbunden werden.
4. Bereiten Sie eine 10 ml-Säule, indem Sie eine Fritte nach unten und läuft PBS pH 7,4 durch. Cap ter Boden der Säule und 2 ml Kopplungspuffer.
5. Fügen Sie das gewünschte Volumen an Schlamm (4 ml bis 2 ml Harz zu erhalten) an die Säule, entfernen Sie die Bodenkappe und lassen Sie die Spalte Drain. Spülen der Säule mit einer Gesamtzahl von 6 ml (3 Harz-Bettvolumen) Kopplungspuffer und damit der Säule ablaufen. Nach der Kupplungspuffer entleert, ersetzen Sie die Bodenkappe.
6. Hinzuzufügen 2-4 ml Protein in Kupplungspuffer suspendiert, um die Säule (keep ein Aliquot der Proteinlösung, um die Kopplungseffizienz, indem die Proteinkonzentration des Eluats in Schritt 2.11 unter Verwendung von entweder der Absorption bei 280 nm oder die Bicinchoninsäure-Assay zu beurteilen) . Kappe und mischen kopfüber, um eine homogene Lösung zu haben.
7. Wiegen Sie eine leere 1,8 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zu bewegen, um den Abzug. Sorgfältig über NaCNBH ₃ (etwa 0,05 g) in der vorgewogen Rohr. Schließen Sie den Schlauch und wiegen die Röhrchen mit NaCNBH _3. Das Rohr Öffnen Sie nicht außerhalb der Haube.
8. Bezogen auf das GewichtNaCNBH ₃ in das Rohr übertragen, machen Sie eine 5 M-Lösung durch Zugabe von 1 M NaOH. Das Molekulargewicht des NaCNBH ₃ 62,84 g deshalb 0,05 g gleich (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 ^-4 Mol) 7,96 x 10 ^-4 mol ist. Um eine 5 M Lösung add (7,96 x 10 ^-4 / 5) 159 ul 1 M NaOH zu machen.
9. Messen Sie Gesamtvolumen der Reaktion der Einnahme des Harzvolumen in Betracht. In 10 ul 5 M NaCNBH ₃ pro ml Reaktions.
   1. Zum Beispiel: für einen 4 ml Reaktionsvolumen werden 40 & mgr; l von 5 M NaCNBH _3. 1 ml Harz und 3 ml zugesetztes Protein, das Gesamtvolumen von 4 ml.
10. Verschließen Sie die Spalte und Mischen über Kopf. Befestigen Sie die Säule an einem Rohr Rotator und ließ die Reaktion über Nacht weiter bei 4 ° C.
11. Am Morgen bringen die Spalte an die chemischen Haube und entfernen Sie die Kappe so etwas Gas gebildet haben sorgfältig. Entleeren Sie die Säule in ein sauberes Röhrchen und speichern Sie das Eluat, das Protein con messentration mit der Absorption bei 280 nm Methode ¹² oder die Bicinchoninsäure-Assay und vergleichen ihn mit dem Ausgangsprotein-Konzentration in Schritt 2.6.
12. Das Harz wird mit 4 ml Kopplungspuffer und lassen Sie die Spalte Drain.

3. Blocking Verbleibende Seiten

1. Mit 4 ml Puffer Abschrecken Waschen des Harzes. Abtropfen lassen und ersetzen Sie die Bodenkappe. 2 ml Puffer und Abschrecken auszusetzen Harzes.
2. Beurteilung des gesamten Reaktionsvolumens durch Messung der Harzvolumen und das Abschrecken Puffervolumen dann werden 10 ul 5 M NaCNBH ₃ pro ml Reaktionsvolumen.
3. Vorsichtig mischen bei Raumtemperatur für 30 min End-Over-End. Nach 30 Minuten bringen Sie die Spalte in der Abzugshaube. Entfernen Sie vorsichtig die obere und dann die untere Kappe und lassen Sie die Spalte Drain in einen Abfallrohr.
4. Mit 5 Harzvolumina Waschlösung Die Säule. Überwachen Sie die Waschanlagen für die Anwesenheit von Restproteine ​​durch Messung des Eluats der absorbance bei 280 nm. Entkoppelt Proteine ​​werden durch die hohe Salzkonzentration gewaschen.
5. Mit 6 ml entgastem PBS pH 7,4, enthaltend 0,02% Natriumazid Waschen des Harzes. Halten der Säule auf 4 ° C, bis es benötigt.

4. Reinigung von Nurr1 spezifischer Antikörper

1. Spülen Sie die Nur77 LBD gekoppelt Säule mit 10 ml PBS pH 7,4 und lassen Sie die Spalte Drain. Verschließen Sie die unteren Ende der Säule und legen Sie das abgelassen Nur77 LBD gekoppelt Säule in ein neues 15 ml Sammelröhrchen.
2. 5 ml Protein A-gereinigten Anti-Nurr1-Antikörpern, die Kappe die Säule und den Platz auf einem Schüttler bei 4 ° C für 1 Stunde. Entfernen Sie die oberen und unteren Kappen und sammeln die Strömung durch. Beiseite auf Eis, bis bereit gesetzt, um zum Nor1 LBD gekoppelt Spalte hinzuzufügen.
3. Spülen Sie die Nor1 LBD gekoppelt Säule mit 10 ml PBS pH 7,4 und lassen Sie die Spalte Drain. Verschließen Sie die unteren Ende der Säule und legen Sie die Nor1 LBD gekoppelt Spalte in einem 15 ml-Collection-Tube.
4. In den Fluss durch von der Nur77 Putsch LBDLED-Säule vom Säule und auf einem Rotator bei 4 ° C für 1 Stunde. Entfernen Sie die oberen und unteren Kappen und sammeln die Strömung durch.
5. Messung der Antikörperkonzentration durch Messung der Absorption bei 280 nm.

5. ELISA-basierte Analyse von gereinigten Anti-Nurr1 Antikörper

1. 100 l Protein (2,5 ug / ml) in die Vertiefungen einer 96 Well-Platte. Wenn die Prüfung 3 verschiedene Proteine ​​wird mit 100 ul Protein 1 die Vertiefungen A1 bis H4 wurden 100 ul Protein 2, die Vertiefungen A5 bis H8 und 100 & mgr; l von Protein 3 zu Vertiefungen A9 bis H12. Die Platte und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
2. Zweimaliges Waschen der beschichteten Wells mit 300 ul pro Napf an PBS, pH 7,4 und 300 ul ELISA Blockpuffer an die gesamte Antigen-beschichteten Vertiefungen und inkubiert 2 h bei Raumtemperatur.
3. Während die Platte blockiert Vorbereitung eines gewünschten Ausgangsverdünnung von gereinigtem anti-Nurr1-Antikörper (im Bereich von 10 bis 100 ug / ml) im ELISA Blockpuffer.
4. Nach 2 Stunden der Sperrung, ersetzen Sie den ELISA-Blockpuffer mit 100 ul frisch ELISA-Blockpuffer in alle Vertiefungen.
5. 100 l des verdünnten gereinigten anti-Nurr1 Antikörper in jede Vertiefung in der Reihe A. Seriell verdünnte die Antikörper durch die Übertragung von 100 ul der Lösung von Reihe A zu den Vertiefungen in der Reihe B, gefolgt von Übertragen von 100 ul der Lösung von Reihe zu Reihe B C Fortsetzung auf G. rudern Nach dem Mischen der Lösungen in den Vertiefungen in der Reihe G entsorgen Sie die zusätzliche 100 ul. Wells in Reihe H erhalten nur die ersten 100 l Blocking-Puffer. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
6. Drei (3) mal mit 300 ul pro Vertiefung von 0,05% Tween 20 waschen Sie die Platte in PBS pH 7,4 und trocknen Sie die Platte, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen.
7. 100 l Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG ELISA in Blockpuffer verdünnt (1: 8.000 Verdünnung; der typische Bereich von 1: 5.000 bis 1: 25.000). Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
8. Waschen Sie die Platte threie (3) mal so in 5.6 beschrieben. Spülen Sie alle Vertiefungen durch mit 300 ul entionisiertem Wasser füllt sie. Tupfen Sie überschüssiges Wasser durch Umdrehen der Platte auf absorbierendes Papier.
9. Füge 100 ul 3, 3 ', 5, 5' Tetramethylbenzidin (auf Raumtemperatur erwärmt) in jede Vertiefung und inkubiert 15 bis 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
10. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2 NH ₂ SO _4.
11. Extinktion bei 450 nm subtrahiert Hintergrund bei 650 nm.

Ergebnisse

Ein Vergleich der Protein A-Säule gereinigt Nurr1-spezifische Antikörper mit Protein A gereinigter anti-Nurr1-Antikörper, gefolgt von Passage durch Nur77 LBD und Nor1 LBD Spalten ist in Figur 1 dar. Wie gezeigt ist ersichtlich, Protein A-gereinigten Nurr1-Antikörper zeigte eine starke Bindungs um Nurr1 LBD. Jedoch zeigte sich auch eine signifikante Bindung an Nur77 LBD und Nor1 LBD. Wenn Protein A-gereinigten Antikörper wurden Nurr1 weiter gegen Nur77 LBD und Nor1 LBD endgültigen affinitätsgerein...

Diskussion

Der Erfolg dieses Protokoll beruht auf der Verfügbarkeit von reinen Proteinen zur Charakterisierung von Antikörpern gegen ein bestimmtes Mitglied der Proteinfamilie von Interesse angehoben. Es besteht keine Notwendigkeit, um die Antikörper unter Verwendung von Protein A / G bis zum deutlich festgestellt, dass es signifikante Kreuzreaktivität mittels ELISA und Western-Blotting zu reinigen.

Wie im Text erwähnt, ist es wichtig zu vermeiden, Suspendieren des Proteins (en) werden auf der Sä...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl