生产交叉反应Nurr-1特异性多克隆抗体免费的针对其关闭同系物，NOR1和Nur77的

摘要

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

摘要

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

引言

转录因子Nurr1基因和它的同系物（Nur77的和NOR1）属于核受体亚家族^{4A（NR4A）1。}它们还孤儿受体，因为它们的内源性配体尚未得到确认。 Nurr1的于1992年首次克隆并虽然已知在脑中表达^2，其用于开发和维护中脑多巴胺神经元的基本作用是揭示基因敲除小鼠的研究^3。另外，它的维修中脑多巴胺神经元的重要作用由一个条件性敲除研究⁴最近被证实。由于这些优雅的研究显示对中脑多巴胺神经元Nurr1基因的关键作用，许多随后的研究主要集中在中脑多巴胺神经元和多巴胺相关的神经退行性疾病，帕金森氏病^（PD）5。

值得注意的是，Nurr1的表达不仅在中脑多巴胺（MDA）的神经元，而且在二节脑区^2，这表明它可具有在许多非DA领域，这强烈地受到最近的研究显示，Nurr1的起着各种大脑功能的重要作用的支持功能作用。对于实施例，它表明存储器诱导活动，如学习，或其它海马依赖性任务导致上调Nurr1的表达在海马^6,7。此外，击倒在海马Nurr1的表达足以削弱长期存储器和/或突触可塑性^8-11，强烈暗示Nurr1基因在许多脑区域起着不同的作用。因此，为了进一步理解Nurr1的的细胞类型特异性和亚细胞表达，理想的是使用Nurr1基因特异性抗体，其不表现出任何交叉反应性，以它的同系物Nur77的或NOR1。本文介绍了一种预吸附协议产生Nurr1的特异性抗体和现在的其他数据显示出其特异性。

研究方案

注意:下面引用的所有解决方案的组合物所用的材料/设备表中找到。

1，蛋白A柱抗体纯化

1. 平衡蛋白A旋转柱和开始的过程之前，所有必需的缓冲器至室温15分钟。
2. 淡化免疫血清1:1的蛋白A的IgG结合缓冲。 （5毫升血清的建议）。
3. 轻轻拍打蛋白质的台式离心柱，以清除可能在帽递交的任何树脂。取下顶盖，轻轻折断底部封闭。放置在一个15毫升的收集管的柱，并允许存储溶液排出。
4. 加入5 ml蛋白A的IgG结合缓冲液，并使溶液排出。
5. 适用的稀释免疫血清到柱并收集流过。为获得最佳效果，添加包含的抗体的浓度小于80％的柱的抗体结合capacit的样品体积年。
6. 用15毫升的蛋白A的IgG结合缓冲液，或直至280nm处的吸光度低于0.1洗柱。
7. 加100ul中和缓冲液的五个标记收集管。
8. 添加5毫升的IgG洗脱缓冲液的蛋白A柱和收取1 ml的组分中含有每100微升和缓冲液的试管中。
9. 测量每个级分在280nm和池组分的吸光度与吸光度大于0.5。置于冰上汇集的分数，直到准备透析。
10. 通过加入8毫升的IgG洗脱缓冲液再生柱子，并允许该溶液流过该柱。
11. 冲洗蛋白A IgG结合的解决方案列中，直到洗脱液pH值恢复到7.4。
12. 加入5毫升的存储溶液（在PBS中0.02％叠氮化钠）存储的列。当约3毫升依然在列，盖底和固定顶盖。储存在4℃下的列。
13. 确定长度Ø根据制造商的说明˚F透析管需要。使用平面直径16毫米油管使用5.47厘米每毫升溶液管长度与进行透析。切管和漂洗用PBS pH 7.4的15至30分钟。
14. 折叠和剪辑透析管的一端，传输汇集的IgG含有级分透析管平衡在pH 7.4的PBS和关闭的另一端。
15. 透析在室温下对200体积pH 7.4的PBS中2小时。
16. 改变透析缓冲液（新鲜的PBS pH 7.4）中和透析另外2小时，在室温下进行。
17. 改变透析缓冲液（新鲜的PBS pH 7.4）中并透析过夜，在4℃。
18. 保持在4℃透析的抗体溶液，直到准备进行进一步的纯化步骤。
19. 评估使用其280nm处的吸光度的抗体浓度和抗体在210,000 M ^{-1 -1 12} 280nm摩尔吸收系数。

2.偶合LBD蛋白质来AminoLink耦合树脂

1. 准备两列，一个用于NOR1，另一个用于Nur77的。按照相同的协议，这两种蛋白。
2. 解冻的蛋白要被连接到在冰上的树脂。确定使用其摩尔消光系数和其在280nm处¹²吸收的蛋白浓度。
   1. 或者，使用蛋白测定法，如二辛可宁酸测定法^13。如果蛋白质溶解在对偶联缓冲液含胺缓冲透析或缓冲液交换。如果所述蛋白质是在合适的缓冲液（无游离胺）稀释4倍于偶联缓冲液。
3. 使用2毫升树脂为2毫克的蛋白质。随后所有的步骤都是2毫升树脂10 ml柱。高达10毫克蛋白质可以每1ml树脂（1浆料2毫升1）被链接。
4. 通过按压玻璃料至底部，并通过它运行pH 7.4的PBS制备10ml的柱。盖牛逼柱的底部，他和加入2ml耦合缓冲。
5. 加浆料的期望体积（4毫升至得到2毫升树脂）到柱上，取下底盖，并让柱漏极。冲洗以总共6毫升偶联缓冲液（3树脂床体积）柱上，使柱排出。经过耦合缓冲区已耗尽，更换底盖。
6. 加2-4 ml蛋白质悬浮于偶联缓冲液的向列（保持该蛋白质溶液的等分试样通过使用吸光度在280nm或二辛可宁测定在步骤2.11比较洗脱液的蛋白浓度来评估耦合效率） 。盖上盖子并混合结束了到底能有一个均匀的溶液。
7. 称量空1.8毫升微量离心管中，并移动到通风橱。小心在预称重管转移的NaCNBH _3（约0.05克）。关闭管，重量含₃的NaCNBH管。不要在外面引擎盖打开管。
8. 基于重量的NaCNBH ₃转移到管中，使通过加入1M的NaOH一个5M的溶液。的NaCNBH ₃的分子量，因此62.84克0.05克等于（0.05 / 62.84 = 7.96×10 ^-4摩尔）7.96×10 ^-4摩尔。为了使5个M解决方案的附加 ​​（7.96×10 ^-4 / 5）159微升1 M氢氧化钠。
9. 测量反应的总量服用树脂体积考虑。加入10微升5米的NaCNBH ₃每毫升反应。
   1. 例如:4ml的反应体积加入40微升5米的NaCNBH _3。对于1毫升树脂和3ml补充蛋白质，总体积为4毫升
10. 盖上列，拌匀结束了尽头。固定在管旋转的柱，并让反应继续过夜，在4℃。
11. 在早晨，把列的化学罩和小心地拧开一些气体可能已经形成。沥干列到一个干净的试管和保存洗脱液测量蛋白质CON中心定位使用280nm处的吸光度方法¹²或二辛可宁酸测定法，并将其与在步骤2.6的起始蛋白质浓度比较。
12. 用4ml偶联缓冲液中洗涤树脂，并让柱漏极。

3.阻止遗址尚存

1. 用4ml淬火缓冲液洗涤树脂。排水和更换底盖。加入2ml缓冲液淬火和暂停树脂。
2. 通过测量树脂体积和淬火缓冲容积然后添加的5M的NaCNBH ₃ 10微升每毫升反应体积的评估的总反应体积。
3. 轻轻混匀，在室温下搅拌30分钟结束过端。 30分钟后，使在通风橱的列。小心取出顶部，然后取下底盖，让列排入废液管。
4. 用洗涤液5树脂体积洗列。通过测量洗脱液的ABSO监视洗涤残余蛋白质的存在rbance 280nm处。未偶联的蛋白质是由高浓度的盐洗出。
5. 用6ml脱气的PBS pH7.4，含有0.02％叠氮化钠洗涤树脂。保持柱在4℃直到需要。

4.净化Nurr1的特异性抗体

1. 冲洗用10毫升的PBS pH值为7.4的Nur77的LBD再加柱，让列流失。帽塔的底部，然后将排水Nur77的LBD耦合柱在一个新15毫升收集管。
2. 加入5 ml蛋白质的纯化的抗Nurr1的抗体，盖在4℃下在旋转器上的柱和地点1小时。除去顶部和底部盖，并收集通过的流动。冰上直至准备预留添加到NOR1 LBD加上列。
3. 冲洗用10毫升的PBS pH值为7.4的NOR1 LBD再加柱，让列流失。帽塔的底部，然后将NOR1 LBD耦合柱在15毫升收集管中。
4. 通过从Nur77的LBD政变添加流导致柱，盖在4℃下在旋转器上的柱和地点1小时。除去顶部和底部盖，并收集通过的流动。
5. 通过测量280nm处的吸光度测定抗体浓度。

纯化的抗Nurr1的抗体5.基于ELISA的分析

1. 加入100微升蛋白（2.5微克/毫升），以96孔板的孔中。如果测试3种不同的蛋白质，添加100微升蛋白1井A1至H4，100微升蛋白2，井A5为H8和100微升蛋白3井A9为H12。覆盖板和孵化一夜之间在4℃。
2. 每个pH 7.4的PBS的井300微升两次洗涤包被的孔，并添加300微升的ELISA阻断缓冲液将整个抗原包被的孔，并在室温下孵育2小时。
3. 而板被阻断制备纯化的抗Nurr1的抗体的所希望的起始稀释液（从10至100微克/毫升）在ELISA中封闭缓冲液。
4. 2小时后阻断，替换用100μl的新鲜的ELISA块缓冲器向所有孔的ELISA块缓冲器。
5. 加入100微升稀释纯化的抗Nurr1的抗体，所有井排A.串行通过将100微升的解决方案，从A行到B行的孔随后转移100微升的解决方案从B行到C行稀释抗体继续向下行G.混合解决方案，井G行丢弃超出100微升之后。在排H井只收到初始100微升封闭缓冲液。在室温下孵育1小时。
6. 在pH 7.4的PBS洗涤该板，每0.05％吐温20以及300微升三（3）次并且吸干板以去除多余的洗涤缓冲液。
7. 添加100μl的辣根过氧化物酶（HRP）缀合的山羊抗兔IgG稀释在ELISA中块缓冲液（1:8000稀释;典型的范围是从1:5000至1:25000）。在室温下孵育1小时。
8. 洗个板块稀土元素（3）倍的5.6中描述。通过用300μl去离子水填充它们冲洗所有孔中。通过倒转板到吸收纸吸干多余的水。
9. 加入100微升3,3'，5,5'四甲基联苯胺（加温到室温）到所有孔中并孵育15至30分钟，在黑暗中在室温下进行。
10. 停止加入的2 50微升的NH ₂ SO ₄的反应。
11. 读450nm处的吸光度在650nm中减去背景。

结果

蛋白质的比较例A纯化柱Nurr1的特异性抗体用蛋白A纯化的抗Nurr1的抗体然后通过Nur77的LBD和NOR1 LBD列通路示于图1。如可以看到的，蛋白A纯化的Nurr1的抗体表现出强结合到Nurr1的LBD。但是，它也表现出显著结合Nur77的LBD，并NOR1 LBD。当蛋白A纯化的Nurr1的抗Nur77的LBD和NOR1 LED，纯化Nurr1的抗体表现出特异性结合Nurr1的LBD检测不到结合Nur77的LBD或NOR1发光二极管，表明其交叉反应性Nur77的和NOR1是最后?...

讨论

此协议的成功依赖于纯蛋白质的提出对感兴趣的蛋白家族的特定成员的抗体鉴定的可用性。没有必要纯化使用蛋白A / G，直到它被明确规定，有显著交叉反应通过ELISA和Western印迹的抗体。

如文中所述，它避免悬浮蛋白（S）以被交联，以在含胺缓冲液如Tris或甘氨酸列是重要的。此外用于交联的最佳蛋白浓度必须根据经验来确定。太在柱上的蛋白质，可能会导致空间位阻，而太?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl