تصنيع يستند إلى PCL النشطة بيولوجيا، "تركيب الذاتي" الشكل الذاكرة البوليمرات سقالة

Summary

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Abstract

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Introduction

تعتبر حاليا معيار الذهب من القحف-الوجه والفكين (CMF) علاجات خلل العظام، وأعاقت زرع الطعوم ذاتي تحصد إجراءات التطعيم معقدة، موقع المانحة الاعتلال ومحدودية ^1. وثمة صعوبة معينة يتم تشكيل وتحديد الطعم الذاتي جامدة بإحكام في عيب من أجل الحصول على الاندماج العظمي ومنع الكسب غير المشروع ارتشاف. وقد تم التحقيق هندسة الأنسجة كاستراتيجية بديلة لتطعيم ذاتي وبدائل العظام الاصطناعية (مثل الاسمنت العظام) ^2،3. حاسمة لنجاح نهج هندسة الأنسجة هو سقالة مع مجموعة محددة من خصائص. أولا، من أجل تحقيق الاندماج العظمي، يجب على سقالة تشكيل اتصال وثيق مع أنسجة العظام المجاورة ^(4). وينبغي أيضا أن يكون سقالة عظمي، والسماح الهجرة الخلية، نشر المغذيات وneotissue ترسب ^4،5. ويتحقق هذا السلوك عادة مع هيئة السلع التموينية القابلة للتحللffolds اظهار التشكل المسام مترابطة للغاية. وأخيرا، يجب أن يكون سقالة النشطة بيولوجيا وذلك لتعزيز التكامل والترابط مع الأنسجة المحيطة عظم ^5.

هنا، نقدم بروتوكول لإعداد سقالة هندسة الأنسجة مع هذه الخصائص. الأهم من ذلك، هذا سقالة المعارض القدرة على "صالح الذاتي" إلى عيوب CMF غير النظامية بسبب شكل السلوك الذاكرة ^6. ومن المعروف أن البوليمرات الذاكرة شكل Thermoresponsive (SMPS) للخضوع لتغيير الشكل عند التعرض للحرارة ^7،8. وتتألف المكاتب الصغيرة من "netpoints" (أي مادة كيميائية أو crosslinks المادية) التي تحدد شكل دائم و "شرائح التحول" التي تحافظ على شكل مؤقت واستعادة شكل دائم. شرائح التبديل يحمل درجة الحرارة الحرارية التي تمر بمرحلة انتقالية (T _{العابرة)} الموافق إما التحول الزجاجي (T _ز) أو تذوب الانتقالية (T _{م) من} البوليمر. مثلنتيجة لذلك، المكاتب الصغيرة قد تكون مشوهة بالتتابع في شكل مؤقت في T> T _{العابرة،} ثابتة في شكل مؤقت في T العابرة، واستعاد لشكل دائم في T> T _{العابرة.} وهكذا، يمكن للسقالة SMP تحقيق "ذاتيا المناسب" في غضون عيب CMF كما يلي ^6. بعد التعرض لتسخين المياه المالحة (T> T _{العابرة)،} سقالة SMP سوف تصبح طيعة، والسماح أسطواني سقالة مستعدة بشكل عام لتكون إلى خلل وعدم انتظام لضغوط ناحية، مع شكل الانتعاش والعمل على توسيع السقالة إلى حد العيب. على التبريد (T العابرة)، فإن سقالة يعود إلى حالته أكثر جمودا نسبيا، مع شكل ثبات الحفاظ على شكله مؤقت جديد داخل هذا العيب. في هذا البروتوكول، ويتم إعداد سقالة SMP من polycaprolactone (PCL)، بوليمر قابلة للتحلل ودرس على نطاق واسع لتجديد الأنسجة والتطبيقات الطبية الحيوية الأخرى ^9-11. للذاكرة الشكل، عشره T _م PCL بمثابة T _عبر وتتراوح ما بين 43 و 60 درجة مئوية، اعتمادا على الوزن الجزيئي للPCL ^12. في هذا البروتوكول، وT _{العابرة} (أي T _{م) من} سقالة هو 56.6 ± 0.3 درجة مئوية ^6.

من أجل تحقيق osteoconductivity، تم وضع بروتوكول لجعل السقالات SMP استنادا PCL مع المسام مترابطة إلى حد كبير على أساس طريقة الصب المذيبات الجسيمات الرشح (SCPL) ^6،13،14. وقد استخدمت diacrylate Polycaprolactone (PCL-DA) (M _{ن =} ~ 10000 جم / مول) للسماح السريع، يشابك الضوئي وحلت في ثنائي كلورو ميثان (DCM) للسماح المذيبات الصب على مدى قالب الملح. وبعد العلاج الضوئي وتبخر المذيبات، تم إزالة قالب الملح الارتشاح في المياه. متوسط ​​حجم الملح ينظم حجم سقالة المسام. الأهم من ذلك، وتنصهر في قالب الملح بالماء قبل الصب مذيب لتحقيق المسام interconnectiviتاي.

تم اضفاء النشاط الحيوي للسقالة SMP من قبل في تشكيل الموقع من طلاء polydopamine على مسام الجدران ^6. وغالبا ما قدم النشاط الحيوي في السقالات بإدراج الزجاج أو السيراميك والزجاج الحشو ^15. ومع ذلك، وهذه قد تؤدي إلى الخواص الميكانيكية هشة غير المرغوب فيها. وقد تبين الدوبامين لتشكيل طبقة رقيقة ملتصقة polydopamine على مجموعة متنوعة من ركائز ^16-19. في هذا البروتوكول، تعرض السقالة SMP إلى الحل الأساسي قليلا (درجة الحموضة = 8.5) الدوبامين لتشكيل طلاء nanothick من polydopamine على جميع الأسطح جدار المسام ^6. بالإضافة إلى تعزيز hydrophilicity السطح لتحسين التصاق الخلية والانتشار، وقد تبين polydopamine أن يكون النشطة بيولوجيا من حيث تشكيل هيدروكسيباتيت (هاب) عند التعرض لمحاكاة السوائل في الجسم (SBF) ^18،20،21. في الخطوة الأخيرة، يتعرض السقالة المغلفة للحرارة العلاج في 85 درجة مئوية (T> T _{العابرة)} WHالتراث الثقافي غير المادي يؤدي إلى سقالة التكثيف. ولوحظ المعالجة الحرارية في السابق على أنها ضرورية للسلوك ذاكرة شكل سقالة، وربما يرجع ذلك إلى مجالات البلورية PCL إعادة تنظيم لأقرب القرب ^14.

نحن بالإضافة إلى ذلك وصف الطرق لوصف السلوك المناسب الذاتي ضمن عيب نموذج غير النظامية، وتشكيل السلوك الذاكرة من حيث دوري الحرارية اختبارات الضغط الميكانيكي التي تسيطر عليها سلالة (أي شكل الانتعاش وتشكيل ثبات)، المسام التشكل، والنشاط الحيوي في المختبر. وتعرض أيضا استراتيجيات لتفصيل خصائص السقالة.

Protocol

1. توليف PCL-DA Macromer

1. تشغيل رد الفعل acrylation.
   1. تزن 20 غراما من PCL-ديول (M _{ن =} ~ 10000 جم / مول) في 250 مل قارورة أسفل جولة مزودة بقضيب مغناطيسي المغطاة تفلون.
   2. حل PCL-ديول في DCM.
      1. إضافة 120 mLlof DCM إلى قارورة (تركيز = 0.17 ز مل /).
      2. وضع الحاجز المطاطي فضفاضة في عنق القارورة وذلك لتجنب تراكم الضغط في حين منع أيضا تبخر DCM.
      3. حل ضجة ل~ 30 دقيقة في ~ 250 دورة في الدقيقة لتذوب تماما البوليمر.
   3. إضافة ~ 6.6 ملغ من 4 dimethylaminopyridine (DMAP) إلى حل وتذوب مع التحريك.
   4. وضع الحاجز المطاطي بشكل آمن في عنق القارورة. يسمح الحل ليستمر التحريك.
   5. من خلال الحاجز المطاطي، تطهير بلطف القارورة مع _N 2 ب ~ 3 دقائق باستخدام إيجابي _N 2 مدخل الضغط إبرة وإبرة المفتوحةكمتنفس.
   6. إزالة مدخل _N 2 ومنفذ.
   7. إضافة 0.56 مل (4.0 ملمول) من ثلاثي الإيثيلامين (ET ₃ N) قطرة قطرة عن طريق حقنة زجاجية مجهزة إبرة من خلال الحاجز المطاطي.
   8. إضافة 0.65 مل (8.0 ملمول) من acryloyl قطرة قطرة كلوريد عن طريق حقنة زجاجية مجهزة إبرة من خلال الحاجز المطاطي.
   9. العودة مدخل _N 2 إلى قارورة والسماح للمحتويات لإثارة تحت ضغط إيجابي _N 2 ب ~ 30 دقيقة.
   10. قبل حرارة حمام الزيت إلى 55 درجة مئوية.
   11. بعد المخصص ~ 30 دقيقة، وإزالة مدخل _N 2 واستبدال الحاجز مع مكثف.
   12. غمر القارورة في حمام الزيت الساخن مسبقا.
   13. السماح محتويات القارورة لاثارة لمدة 20 ساعة.
   14. بعد تخصيص 20 ساعة، وإزالة قارورة من حمام الزيت والسماح محتويات لتبريد لRT.
   15. باستخدام المبخر الدوار، وإزالة DCM المذيب من القارورة.
2. Purify المنتج PCL-DA الخام.
   1. إلى القارورة، إضافة ~ 135 مل من خلات الإيثيل وحل الخام PCL-DA.
   2. خطورة تصفية حل من خلال ورق الترشيح في نظيفة 250 مل قارورة أسفل جولة. (ملاحظة: الحل قد رشاقته على ورقة الترشيح، لا يمر بسهولة من خلال إذا كان الأمر كذلك، تطبيق بعناية حرارة معتدلة بمسدس التدفئة.)
   3. باستخدام المبخر الدوار، وإزالة خلات الإيثيل المذيبات من القارورة.
   4. إلى القارورة، إضافة ~ 140 مل من DCM وحل الخام PCL-DA.
   5. نقل المحتويات إلى 500 مل قمع فصل.
   6. إلى القمع، إضافة 13.5 مل من 2 M كربونات البوتاسيوم (K _{2 3} CO).
   7. سقف القمع. المزيج بلطف طبقتين بواسطة قلب القمع ويحوم مرة واحدة أو مرتين بلطف، مع الحرص على اطلاق سراح الضغط عن طريق محبس. كرر 3 مرات.
   8. استبدال الغطاء بطبقة من parafilm والسماح للخليط لفصل O / N (~ 12 ساعة).
   9. جمع القاع، أوطبقة غانيتش في قارورة 250 مل مخروطي.
   10. إضافة ~ 5 غرامات من اللامائية كبريتات المغنيسيوم (MgSO ₄₎ إلى القارورة ودوامة بلطف.
   11. خطورة تصفية الخليط من خلال ورقة مرشح والنوعية في نظيفة 250 مل قارورة أسفل جولة.
   12. باستخدام المبخر الدوار، وإزالة DCM المذيب من القارورة.
   13. الجافة تحت فراغ عالية لإزالة المتبقي DCM. (ملاحظة: PCL-DA يجب أن يتم تخزينها بعيدا عن الضوء.)
   14. تأكيد acrylation مع ¹ H NMR ^22،23.

2. إعداد SMP سقالة (الشكل 1)

1. إعداد قالب الملح المنصهر.
   1. استخدام منخل 425 ميكرون للحصول على كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) الجسيمات ~ 460 ± 70 ميكرون في القطر. (ملاحظة: متوسط ​​حجم الجسيمات يمكن تأكيد من المجهر الإلكتروني [SEM] الصور مع برنامج يماغيج.) ¹⁴
   2. إلى قنينة زجاجية 3 مل (ID = 12.9 مم)، إضافة 1.8 غرام من كلوريد الصوديوم منخول سابقا.
   3. إضافة ببطء، في أربعة أجزاء، 7.5٪ بالوزن (على أساس الوزن الملح) المياه DI (0،146 ز) إلى القارورة. تخلط مع ملعقة معدنية بعد إضافة كل جزء من الماء.
   4. سقف القارورة، والتفاف في الأنسجة ووضع عموديا في أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 3220 ز س.
   5. إزالة الغطاء وترك O-الهواء الجاف / N (~ 12 ساعة).
2. في قارورة زجاجية جديدة، وإعداد "حل macromer" من خلال الجمع بين 0.15 غرام من PCL-DA لكل مل من DCM. (ملاحظة: للحصول على سقالة واحد، ~ 1 مل من محلول ينبغي إعداد) كاب وتخلط الحل بسرعة عالية على خلاط دوامة ل~ 1 دقيقة.
3. في الجديدة 3 مل قنينة زجاجية، وإعداد "حل photoinitiator" على أساس 10٪ بالوزن 2،2-dimethoxy-2-فينيل acetophenone (DMP) في 1-فينيل-2-pyrrolidinone (NVP). الجمع بين 0.115 غرام من DMP في 1 مل من NVP. (ملاحظة: للحصول على سقالة واحد، ~ مطلوب 180 ميكرولتر.) قبعة، والتفاف في رقائق الألومنيوم (لمنع الضوء) وتخلط الحل بسرعة عالية على خلاط دوامةل~ 1 دقيقة. (ملاحظة: إذا أعدت في مرحلة متقدمة، يجب تبريد الحل ومحمية من الضوء.)
4. التفاف القارورة التي تحتوي على حل macromer (باستثناء الغطاء) بورق الألمنيوم (لمنع الضوء) وإضافة عن طريق ماصة المجلد 15٪ (على أساس الحجم الكلي للحل macromer) من الحل photoinitiator. غطاء وتخلط الحل بسرعة عالية على خلاط دوامة ل~ 1 دقيقة.
5. التفاف القارورة التي تحتوي على قالب الملح المنصهر (باستثناء الغطاء) بورق الألمنيوم (لمنع الضوء) وإضافة عن طريق ماصة الحل macromer / photoinitiator معدة مسبقا (~ 0.6 مل أو حتى القالب مغطى تماما).
6. سقف القارورة، والتفاف في الأنسجة ووضع عموديا في أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1260 x ج لتوزيع الحل macromer في جميع أنحاء القالب.
7. إزالة رقائق الألومنيوم، إرفع قبعة القارورة وفضح لضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر، 25 W) لمدة 3 دقائق. O الهواء الجاف / N.
8. إزالة "scaffol التي تحتوي على الملحد "من القارورة مع ملاقط بعد أن سجل وكسر الجزء العلوي من قارورة زجاجية.
9. في كوب 400 مل، وإعداد ~ 200 مل من الماء / الإيثانول المذيبات (1: 1 المجلد: المجلد).
10. الحفاظ على سقالة غارقة في المياه / الإيثانول المذيبات لمدة 4 أيام مع التغييرات المذيبات اليومية.
11. إزالة السقالة من المذيبات والهواء الجاف O / N.

3. تطبيق Polydopamine طلاء لSMP سقالة (الشكل 1)

1. في 400 مل دورق مزودة بقضيب المغطاة تفلون، وإعداد ~ 200 مل من محلول الدوبامين هيدروكلوريد (2 ملغ / مل في 10 ملي تريس العازلة، ودرجة الحموضة = 8.5، 25 درجة مئوية). إثارة في ~ 150 دورة في الدقيقة.
2. وضع إبرة يمكن التخلص منها (الطول = 40 مم؛ مقياس = 20) في سقالة، ~ نصف المسافة من خلال منصة الاعدام. لف سلك حول محور الإبرة.
3. غمر سقالة (مع محور إبرة فوق سطح الحل) في حل الدوبامين التحريك من خلال ربط السلك إلى حافة الكأس.
4. ديغا السقالة عن طريق وضع الحقنة في محور إبرة واستخدامها لسحب الهواء من السقالة. (ملاحظة: إفراغ الغاز اكتمال عندما لا مزيد من الهواء يمكن إزالة والحل قد تسللت تماما السقالة).
5. الحفاظ على سقالة غارقة في حل الدوبامين مع التحريك لمدة 16 ساعة.
6. إزالة السقالة من الحل وإزالة الإبرة. يشطف بالماء DI وجاف في فرن فراغ في RT لمدة 24 ساعة.
7. ضع سقالة في الفرن 85 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
8. السماح للسقالة لتبريد لRT. سوف سقالة اسطوانية النهائية ستكون ~ 6 مم قطر × ~ 5 مم الارتفاع.

4. تقييم سلوك "تركيب الذاتي"

1. إعداد "CMF نموذج عيب عدم انتظام" باستخدام ورقة من البلاستيك القوي الذي سمك غير ~ 5 مم. استخدام الحفر لخلق فراغا داخل ورقة من البلاستيك مع متوسط ​​قطرها أقل قليلا من ~ 6 مم، كما هو موضح في الشكل 2A.
2. في أبايكر، المياه DI الحرارة (الذي يمثل الاستخدام السريري من المياه المالحة) إلى درجة حرارة 60 درجة مئوية ~.
3. ضع سقالة في كوب من ~ 60 درجة مئوية الماء. استخدام ملاقط لدفع سقالة تحت سطح الماء، وفضح كافة المجالات إلى الماء. يستمر ل~ 2 دقيقة أو حتى خففت السقالة بشكل ملحوظ (الشكل 2B).
4. إزالة السقالة من كوب واضغط على الفور (باليد) إلى خلل نموذج.
5. السماح لتبرد لRT (~ 5-10 دقيقة) (الشكل 2C).
6. إزالة من خلل لمراقبة، شكل مؤقت ثابت جديد وعودة الدولة أكثر جمودا نسبيا (الشكل 2D).

5. اختبار الشكل الذاكرة السلوك

1. باستخدام محلل الميكانيكي الحيوي (DMA؛ على سبيل المثال TA الآلات Q800 كما المستخدمة هنا)، تشغيل دوري الحرارية اختبار ضغط الميكانيكية التي تسيطر عليها الضغط على سقالة على دورتين (N) لتحديد شكل ثبات (R _{و) و}تشكيل الاسترداد (R _ص) (الشكل 3).
   1. تتوازن إلى 60 درجة مئوية _(عالية T) لمدة 5 دقائق.
   2. ضغط إلى أقصى سلالة (ε _م = 50٪) في 50٪ / دقيقة.
   3. عقد في ε _{م (5} دقائق).
   4. بارد إلى 25 ° C (T _منخفض) والحفاظ على لمدة 10 دقيقة لإصلاح شكل مؤقت.
   5. إزالة هذا العبء.
   6. قياس الضغط في نهاية المطاف في دولة خالية من الإجهاد (ε _ش).
   7. يسخن إلى 60 درجة مئوية _(عالية T) والحفاظ على لمدة 10 دقيقة لاستعادة شكل دائم.
   8. قياس الضغط تعافى (ε _ع).
   9. في حين لا يزال في 60 ° C _{(ارتفاع} T)، تبدأ دورة ^{الثانية} 2 (N = 2) عن طريق ضغط السقالة إلى 50٪ من ارتفاع تعافى بعد ^الحادي دورة 1 (N = 1).
   10. كرر 5.1.3-5.1.8 لN = 2.
   11. حساب R _و R و _R لN = 1 و 2 باستخدام المعادلات التالية:
       R _و (N) = [ε _ش (N) / ε _م] R _ص (N) = [ε _{م -} ε _ص (N)] / [ε _{م -} ε _ص (N -1)]

6. تصور حجم المسام والمسام ربط بيني

1. باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM، على سبيل المثال الاتحاد الدولي للفروسية كوانتا SEM المستخدمه هنا)، ومراقبة حجم المسام والمسام الترابط.
   1. باستخدام الملقط لعقد سقالة SMP، غمر في السائل N ₂ لمدة 1 دقيقة.
   2. إزالة من N السائل ₂ وكسر على طول منتصف سقالة بشفرة حلاقة نظيفة.
   3. باستخدام شريط الكربون، يلصق أحد نصفي SMP سقالة على عينةالمرحلة مع سطح بكسر مواجهة.
   4. تفل معطف مع الاتحاد الافريقي حزب العمال (~ 4 نانومتر).
   5. التقاط صورة SEM في الجهد تسريع الموصى بها من 10-15 كيلو فولت (الشكل 4A).

7. اختبار في المختبر النشاط الحيوي

1. في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، إضافة ~ 30 مل من 1X SBF ^24.
2. الحصول على سقالة في الأصلي، شكل دائم مصبوب إسطوانيا من العام. قطع سقالة في نصف (عبر الحافة الدائرية) باستخدام شفرة نظيفة.
3. وضع النصف سقالة الفردية في أنبوب الطرد المركزي مستعد والغطاء.
4. الحفاظ على أنبوب عند 37 درجة مئوية في حمام الماء تحت ظروف ثابتة مع أية تغييرات SBF.
5. بعد 14 يوما، إزالة السقالة من SBF والهواء الجاف لمدة 24 ساعة.
6. باستخدام شريط الكربون، يلصق السقالة على خشبة المسرح عينة مع سطح بكسر مواجهة.
7. تفل معطف مع الاتحاد الافريقي حزب العمال (~ 4 نانومتر).
8. التقاط صورة SEM في إعادةوأشاد تسريع الجهد من 10-15 كيلو فولت (الشكل 4B).

النتائج

الناتج استنادا PCL-SMP سقالة قادرة على إلى نموذج CMF خلل في تركيب النفس (الشكل 2). بعد التعرض قصيرة لتدفئة المياه المالحة (~ 60 ° C)، سقالة اسطوانية يلطف السماح السقالة إلى أن الضغط يدويا في وتوسع في عيب نموذج. بعد التبريد لRT، يتم إصلاح سقالة في شكله المؤقت الجديد الذي...

Discussion

يصف هذا البروتوكول إعداد، سقالة استنادا PCL-المغلفة polydopamine التي السلوك المناسب النفس، وكذلك osteoinductivity والنشاط الحيوي، يجعل من الفائدة في علاج عدم انتظام عيوب العظام CMF. قد يتم تغيير جوانب البروتوكول لتغيير ملامح مختلفة سقالة.

بروت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Triethylamine (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Acryloyl chloride	Sigma-Aldrich	A24109
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
Potassium carbonate (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher	M65
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Dopamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	H8502
Tris buffer (2mol/L)	Fisher	BP1759	Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve	VWR	47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA)	TA Instruments	Q800
High Resolution Sputter Coater	Cressington	208HR
Scanning Electron Microscope (SEM)	FEI	Quanta 600