生物活性，PCL为基础的"自我装配"形状记忆聚合物支架的制备

摘要

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

摘要

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

引言

目前考虑的颅颌面（CMF）骨缺损治疗的金标准，收获的自体移植的移植是由复杂的移植手术，供体部位发病率和有限¹阻碍。一个特别困难被整形并紧紧固定在刚性移植到缺陷，以获得骨整合和预防移植物吸收。组织工程已被调查作为一种替代战略，以自体移植和人工合成骨替代品（ 如骨水泥^）2,3。关键的组织工程方法的成功是一组特定属性的支架。第一，为了实现骨整合，支架必须形成与相邻的骨组织⁴紧密接触。该支架也应该是骨传导，允许细胞迁移，营养扩散和neotissue沉积^4,5。这种行为通常是实现了与可生物降解的SCAffolds表现出高度互联的孔结构。最后，该支架应的生物活性，以促进融合和粘接与周围骨组织^5。

在这里，我们提出了一个协议，准备组织工程支架具有这些属性。重要的是，这种支架显示能力的"自我适应"到，由于其形状记忆行为⁶不规则的CMF缺陷。温敏形状记忆聚合物（SMP系统）是已知的在暴露于经受形状改变以加热^7,8。中小事务所是由"netpoints"（即化学或物理交联），这决定了永久的形状和"转换段"，它保持暂时形状，并恢复永久的形状。开关段表现出相应于任一所述的玻璃化转变（T _克 ）热转变温度（T _反式）或熔融聚合物的转变_（Tm值）。由于其结果，污水收集可以顺序变形为暂时形状在T> T _反式，在T 反式固定在暂时形状，并恢复到在T> T _反式的永久形状。因此，SMP支架可以实现"自我装配"中的CMF缺陷如下^6。曝光后，以温盐水（T> T _转 ），一个SMP支架将成为延展性，允许一个一般制造的圆筒状的支架是用手压成不规则的缺陷，具有形状恢复促进扩大脚手架的缺陷边界。在冷却（T 反式），脚手架将回到其相对更为刚性的状态，具有形状固定性保持缺陷在其新的临时形状。在这个协议中，将SMP支架选自聚己内酯（PCL）中制备，可生物降解的聚合物广泛研究的组织再生和其它生物医学应用^9-11。对于形状记忆，日PCL电子_Tm值用作经t _反式和43之后60°C之间变化，取决于在PCL ^12的分子量。在这个协议中，支架的Ť _反式 （即_Tm值）是^{56.6±0.3ºC6。}

为了达到骨传导性，协议的开发，使PCL基的SMP支架与基于溶剂的铸造颗粒淋（SCPL）方法^6,13,14高度互连的孔。聚己内酯丙烯酸酯_{（PCL-DA）（Mn}为=〜10,000g / mol的）得到使用，以允许快速，光化学交联和溶解于二氯甲烷（DCM），以允许溶剂浇铸在盐模板。以下光化学固化和溶剂蒸发，盐模板除去浸出到水中。平均盐大小调节支架孔径。重要的是，该盐模板融合用水之前溶剂浇铸实现孔隙interconnectiviTY。

生物活性传授给了SMP的支架原位形成聚多巴胺涂到孔壁^6。生物活性通常通过包含玻璃或玻璃-陶瓷填料¹⁵引入到支架。但是，这些可能引起不必要的易碎的机械性能。多巴胺已经显示，以形成对各种基材^16-19中粘附，薄聚多巴胺层。在这个协议中，将SMP支架进行多巴胺的弱碱性溶液（pH = 8.5），以形成聚多巴胺的所有孔壁表面⁶ nanothick涂层。除了 ​​增强表面的亲水性以改进细胞粘附和传播，聚多巴胺已被证明是生物活性在形成的羟基磷灰石（HAP）在暴露于模拟体液^{（SBF）18,20,21}的条款。在最后的步骤，将涂覆的支架被暴露在85℃（T>Ť _反式）的wh热处理ICH导致脚手架致密化。热处理是前面提到的是为支架的形状记忆行为所必需的，或许是由于PCL结晶 ​​区域重组，以更接近^14。

我们另外描述的方法中的不规则缺陷模型的自装配行为表征，形状记忆行为而言 ​​应变控制环状热机械压缩试验（即形状恢复和形状固定性），孔的形态，并在体外生物活性 。策略定制支架性能也提出了。

研究方案

1.合成PCL-DA大分子单体

1. 运行丙烯酸酯化反应。
   1. 重20克的PCL二醇_（Mn为=〜10,000g / mol的）的成250ml圆底烧瓶装配有聚四氟乙烯覆盖的磁力搅拌棒。
   2. 化解PCL二醇在DCM。
      1. 添加120 mLlof DCM至烧瓶（浓度= 0.17克/毫升）。
      2. 放置一个橡胶隔膜松散到烧瓶的颈部，以避免压力积聚，同时也防止DCM中蒸发。
      3. 在〜250rpm下为约30分钟搅动溶液以完全溶解聚合物。
   3. 添加〜6.6​​毫克的4-二甲基氨基吡啶（DMAP）到溶液中，溶解并搅拌。
   4. 放置一个橡胶隔膜牢固地插入烧瓶颈部。让溶液继续搅拌。
   5. 通过橡胶隔膜，轻轻用正_的 N 2压力针入口和一开放针吹扫烧瓶用N _2〜3分钟作为出口。
   6. 取出_N 2入口和出口。
   7. 通过配备有穿过橡胶隔片插入一针的玻璃注射器添加0.56毫升（4.0毫摩尔）三乙胺（的Et ₃ N）的溶液。
   8. 通过配备有穿过橡胶隔片插入一针的玻璃注射器添加0.65 ml的丙烯酰氯滴加（8.0毫摩尔）。
   9. 返回_的 N 2入口到烧瓶中，并允许内容物在正_N 2压力搅拌〜30分钟。
   10. 预加热的油浴至55ºC。
   11. 所分配的〜30分钟后，除去_N 2入口和有冷凝器替换隔膜。
   12. 淹没烧瓶到预加热的油浴中。
   13. 允许烧瓶的内容物搅拌20小时。
   14. 所分配的20小时后，除去从油浴中的烧瓶中，并允许内容​​物冷却至室温。
   15. 使用旋转蒸发器，从烧瓶中除去DCM溶剂。
2. Purify粗PCL-DA产品。
   1. 向该烧瓶中，添加〜135毫升乙酸乙酯和溶解粗的PCL-DA。
   2. 重力过滤通过滤纸将溶液倒入干净250ml圆底烧瓶中。 （注:溶液可增稠在滤纸上，不容易穿过如果是这样，仔细地施加温和热用加热枪。）
   3. 使用旋转蒸发器，除去乙酸乙酯从烧瓶溶剂。
   4. 向该烧瓶中，添加140〜毫升DCM并溶解粗的PCL-DA。
   5. 传送内容至500ml分液漏斗中。
   6. 到漏斗中，添加13.5毫升2M碳酸钾_（K 2 CO _3）。
   7. 盖上漏斗。轻轻倒置漏斗和打旋轻轻一次或两次，照顾经由旋塞以释放压力混合两层。重复3次。
   8. 替换用一层石蜡膜的盖，并允许该混合物分离O / N（〜12小时）。
   9. 收集底部或加尼奇层放入250毫升锥形瓶中。
   10. 添加〜5克无水硫酸镁（ _硫酸镁 ）到烧瓶中，轻轻地旋转。
   11. 重力过滤通过定性滤纸和到一个干净的250ml圆底烧瓶中的混合物。
   12. 使用旋转蒸发器，从烧瓶中除去DCM溶剂。
   13. 在高真空下干​​燥，以除去残留的DCM。 （注:PCL-DA应避光保存。）
   14. 确认丙烯酸化^用 1 H-NMR ^22,23。

2.准备SMP脚手架（图1）

1. 制备熔盐模板。
   1. 使用425微米的筛子，直径获得的氯化钠（盐）颗粒〜460±70微米。 （注:平均粒径可以由扫描电子显微镜[SEM]图片包含的ImageJ软件确认^。）14
   2. 向3毫升的玻璃小瓶（ID = 12.9Hz MM），添加1.8克本预先过筛的NaCl。
   3. 慢慢添加，分四份，7.5重量％（基于重量盐）去离子水（0.146克）到小瓶中。混合通过加入水每个部分的后一个金属刮刀。
   4. 帽小瓶中，包裹在组织和放置垂直插入一个离心管中。离心15分钟，在3220×g下。
   5. 取下盖子，让空气干燥O / N（〜12小时）。
2. 在一个新的玻璃小瓶，准备了"单体溶液"相结合，0.15克每毫升DCM的PCL-DA的。 （注意:对于一种脚手架，〜1毫升溶液应制备）盖上盖子并混合溶液在高速在涡旋混合器上为约1分钟。
3. 在一个新的3毫升玻璃小瓶中，准备基于10重量％的2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMP）中的1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP）一个"光引发剂溶液"。结合0.115克DMP在1ml的NVP。 （注:其一支架，〜180微升是必需的。）帽，包装在铝箔（阻挡光）和混合解决方案，在高速上的旋涡混合器对于〜1分钟。 （注意:如果在先进制备，该溶液应冷藏并避光。）
4. 包裹含有大分子单体溶液（不包括帽）用铝箔小瓶（方框光），并通过移液管添加15体积％（基于大分子单体溶液的总体积）的光引发剂的溶液。盖上盖子并混合溶液在高速在涡旋混合器上为约1分钟。
5. 用铝箔包装含有熔融盐模板（不包括帽）小瓶（方框光），并通过移液管添加预先制备的大分子单体/引发剂溶液（〜0.6 ml或直到模板被完全覆盖）。
6. 帽小瓶中，包裹在组织和放置垂直插入一个离心管中。离心10分钟，在1260×g离心来分发整个模板的大分子单体溶液。
7. 取下铝箔，开盖小瓶并暴露于UV光（365纳米，25瓦）下3分钟。风干O / N。
8. 删除"含盐的scaffol从具有得分和压裂玻璃瓶后上方镊子小瓶D"。
9. 在400毫升烧杯中，准备约200毫升水/乙醇溶剂（1:1体积:体积）。
10. 保持浸没在水/乙醇溶剂4天每日溶剂改变该支架。
11. 取下溶剂，空气干燥O / N的支架。

3.应用聚多巴胺涂层以SMP脚手架（图1）

1. 在400毫升烧杯中装配有聚四氟乙烯覆盖搅拌棒，准备约200毫升的盐酸多巴胺溶液（在10mM Tris缓冲液2毫克/毫升，pH值= 8.5，25℃）。在搅拌〜150转。
2. 一半的距离通过该支架到所述支架，〜;放置一个一次性针（表= 20长度= 40毫米）。环绕所述针毂的线材。
3. 由锚定线到烧杯的边缘淹没该支架（与溶液表面上方的针毂）加入搅拌中的多巴胺溶液。
4. 通过将注射器插入针毂，并用它拉空气从支架的脱气脚手架。 （注:除气完成时，没有更多的空气可以被除去，该溶液已完全渗入该支架。）
5. 保持浸没在16小时的搅拌多巴胺溶液中的脚手架。
6. 从溶液中除去所述支架和取出针。用DI水和干燥，在真空烘箱中在室温放置24小时冲洗。
7. 放置在一个85ºC烘箱该支架1小时。
8. 让脚手架冷却至室温。最终的圆柱形支架会〜6毫米直径×约5毫米的高度。

4.评估"自我装配"行为

1. 制作"不规则CMF缺陷模型"使用硬质塑料，其厚度为约5毫米的片材。使用钻头来创建塑料片内的空隙，平均直径大于〜6毫米略少，这表现在图2A中。
2. 在AB埃克，热DI水（相当于本临床使用生理盐水）至〜60℃的高温。
3. 放置支架到烧杯〜60ºC水。使用镊子推水面下的脚手架，露出所有区域到水中。继续为〜2分钟或直到支架是明显软化（ 图2B）。
4. 取下烧杯中的脚手架，并立即按下（手动）到模型的缺陷。
5. 允许冷却至室温（〜5-10分钟）（图2C）。
6. 从缺陷除去以观察新的，固定的临时形状和相对更刚性的状态（图2D）的返回。

5.测试形状记忆行为

1. 使用动态机械分析仪（DMA;例如TA仪器Q800如本文所用），运行在支架一个应变控制环状热机械压缩测试超过两个周期（N），来确定形状固定性（R _f）和形状恢复_（R R）（ 图3）。
   1. 平衡至60℃（T _高 ）5分钟。
   2. 压缩到最大应变（ε _米 = 50％）以50％/分钟。
   3. 保持在ε _米（5分钟）。
   4. 冷却至25℃（T _低 ），并保持10分钟以固定暂时形状。
   5. 除去负载。
   6. 测量在无压力状态下的极限应变_（εU）。
   7. 再加热至60℃（T _高 ），并且维持10分钟，以恢复永久形状。
   8. 测量回收的应变_（εp）的 。
   9. 同时仍然在60℃（T _高 ），由支架压缩到^第 1次循环后回收的高度（N = 1）的50％开始^第 2次循环（2 N =）。
   10. 重复5.1.3-5.1.8对于N = 2。
   11. 使用以下公式计算R _{f和R r表示} ，N = 1和2:
       _的 R F（N）= _{[εU（N）/εM] R} R（N）= [ε _{米- εP（N）]} / [ε _{米- εP（N-1）]}

6，可视化孔径和孔互连性

1. 使用扫描电子显微镜（SEM;例如一个FEI广达SEM如本文所用），观察孔径和孔互连性。
   1. 利用镊子以保持SMP支架，淹没在液体_N 2 1分钟。
   2. 从液体_的 N 2和断裂以及一个干净的刀片支架的中间除去。
   3. 使用碳纤维带，加盖SMP支架半一到样品舞台断裂面朝上。
   4. 溅射涂层与金铂（〜4纳米）。
   5. 捕获SEM图像在10-15千伏（图4A）推荐的加速电压。

7.测试其体外生物活性的

1. 到50毫升离心管中，加入约30毫升1X SBF ^24。
2. 获得在其原始的，圆筒状成型永久形状的支架。切用干净的刀片一半的支架（跨圆边）。
3. 放置一个单独的支架一半到准备好的离心管和帽。
4. 保持所述管在37℃下在无SBF更改静态条件下的水浴。
5. 14天后，取出从SBF和空气干燥的支架24小时。
6. 使用碳纤维带，加盖支​​架上的断裂面朝上的样品台。
7. 溅射涂层与金铂（〜4纳米）。
8. 捕获的SEM图像在重赞扬10-15千伏（ 图4B）加速电压。

结果

将所得的PCL基SMP支架是能够自我装配到一个模型CMF缺陷（图2）的。短暂暴露后温热盐水（〜60℃），圆柱形支架软化允许支架进行手动压入并展开模型缺损内。冷却至RT后，支架被固定到被从缺陷保留在除去其新的临时形状。

一个SMP支架材料的形状记忆行为由应变控制环状热机械压缩试验在形状固定性（R _f）和形状恢复_（R R）（图3）...

讨论

这个协议描述了一种聚多巴胺涂覆的，PCL-基于支架，其自入行为的制备，以及骨诱导性和生物活性，使得在不规则CMF骨缺损的治疗兴趣它。该协议的各方面可以被改变，以改变各种支架功能。

该协议开始于PCL二醇，允许UV固化的丙烯酸酯化。在所报告的实例中，PCL二醇_Mn为是〜10,000g / mol的。然而，通过适当地调整丙烯酰氯量和的Et _{3 N}的PCL-DA了PCL二醇可以被用?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Triethylamine (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Acryloyl chloride	Sigma-Aldrich	A24109
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
Potassium carbonate (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher	M65
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Dopamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	H8502
Tris buffer (2mol/L)	Fisher	BP1759	Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve	VWR	47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA)	TA Instruments	Q800
High Resolution Sputter Coater	Cressington	208HR
Scanning Electron Microscope (SEM)	FEI	Quanta 600