Bir Biyoaktif, PCL-temelli "Kendinden uydurma" Shape Memory Polymer İskele imalatı

Özet

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Özet

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Giriş

Şu anda cranio-maksillofasiyal (CMF) kemik defekti tedavilerin altın standardını kabul hasat otolog greft nakli karmaşık aşılama işlemleri, donör saha morbiditesi ve sınırlı sayıda ^{1 ile} engellenmektedir. Belirli bir zorluk şekillendirme ve osseointegrasyon elde etmek ve greft emilmesini önlemek için defekt içine sıkıca sert otogreft tamir ediyor. Doku mühendisliği bir otograftlama alternatif strateji ve sentetik kemik ikame (örneğin kemik çimentosu) ^2,3 olarak incelenmiştir. Doku mühendisliği yaklaşımının başarısı için kritik özelliklerin belirli bir set ile bir iskele olduğunu. İlk olarak, kemik entegrasyonunu elde etmek için, skafold, bitişik kemik dokusunun ⁴ ile yakın bir temasın oluşturulması gerekir. Iskele aynı zamanda hücre göçü, besin difüzyon ve neotissue birikim ^4,5 izin, osteokondüktif olmalıdır. Bu davranış genellikle biyolojik olarak parçalanabilir SCA ile elde edilirffolds oldukça birbirine bağlı gözenek morfolojisi sergileyen. Kemik dokusu ⁵ çevreleyen ile entegrasyon ve bağ teşvik edecek şekilde Son olarak, iskele biyoaktif olmalıdır.

Burada, bu özelliklere sahip olan, bir doku mühendisliği iskelesi hazırlamak için bir protokol mevcut. Önemlisi, bu iskele de şekil bellekli davranışı ⁶ nedeniyle düzensiz CMF kusurları içine "self-fit" yeteneği sergiler. Thermoresponsive Şekil belleği olan polimerler (BBOP) ^7,8 ısıya maruz kalma üzerine şekil değişimine maruz bilinmektedir. BBOPler kalıcı şekil ve geçici şeklini korumak ve kalıcı şekil kurtarmak "geçiş segmentleri" belirleyen "netpoints" (yani kimyasal veya fiziksel çapraz bağlarının) oluşur. Sviçleme bölümleri, ya cam geçiş _(T g) karşılık gelen bir ısı geçiş sıcaklığına (T _trans) sergileyen veya polimerin geçiş _(Tm) eritin. AsSonuç olarak, BBOPler ardışık T trans geçici şekli sabit T> T _trans geçici bir şekil, deforme ve T> T _trans kalıcı şekil geri kazanılabilir. ⁶ aşağıdaki gibi Böylece, bir SMP skafold CMF kusur içinde "kendi kendine bağlantı" elde edebiliriz. Temastan sonra tuzlu su (T> T _trans), bir SMP iskele şekil kurtarma kusur sınırına iskele genişleme teşvik ile, el-preslenmiş düzensiz bir defekt içine olmak için jenerik hazırlanan silindirik iskele izin, dövülebilir olacaktı ısınmak için. (T trans) Soğuduktan sonra, iskele şekil fixity defekti içinde yeni geçici şeklini muhafaza ile nispeten daha sert hale dönecekti. Bu protokol, bir SMP skafold biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer, doku rejenerasyonu ve diğer biyomedikal uygulamalar ^9-11 için yoğun çalışmalar, polikaprolakton (PCL) hazırlanır. Şekil hafızası için, inciPCL e _Tm T _trans olarak görev yapar ve PCL ¹² arasında molekül ağırlığına bağlı olarak, 43 ve 60 ° C arasında değişir. Bu protokolde, iskele T _trans (yani T _m) 56.6 ± 0.3 ºC ^6.

Osteoconductivity elde etmek için bir protokol, çözücü döküm parçacık-liç (SCPL) yöntemine ^6,13,14 dayanan son derece birbirlerine bağlı gözenekleri PCL tabanlı SMP iskeleleri yapmak için geliştirilmiştir. Polikaprolakton diakrilat (PCL-DA) (M _{n =} ~ 10.000 g / mol), hızlı, fotokimyasal çapraz bağlanmasını izin vermek için kullanılmıştır ve tuz şablonu içinde solvent döküm izin vermek için diklorometan (DCM) içinde çözülmüştür. Fotokimyasal tedavi ve çözücü buharlaştırma sonrasında, tuz şablonu su içine damıtılması yoluyla uzaklaştırılmıştır. Ortalama tuz boyutu iskele gözenek boyutu düzenler. Önemli olarak, tuz şablonu önce gözenek interconnectivi elde etmek için döküm çözücü madde su ile kaynaştırıldıty.

Biyoaktivite delik duvarlarının ⁶ üzerine polydopamine kaplamanın in situ oluşumu ile SMP iskele kazandırılan edildi. Biyoaktivite genellikle cam ya da cam-seramik dolgu ¹⁵ dahil edilerek iskeleler sokulur. Bununla birlikte, bu istenmeyen kırılgan mekanik özellikler ortaya çıkarabilir. Dopamin alt tabakalar ^16-19 çeşitli yapışkan bir ince polydopamine tabakası oluşturmak için gösterilmiştir. Bu protokol, SMP skafold, tüm gözenekli duvar yüzeyleri ⁶ polydopamine bir nanothick kaplama oluşturmak için dopamin hafif bazik çözelti (pH = 8.5) tabi tutuldu. Geliştirilmiş hücre yapışması yüzey hidrofilikliğini arttırmak ve yayma ek olarak, polydopamine yapay vücut sıvısı (SBF) ^18,20,21 maruziyet üzerine hidroksiapatit oluşumu (HAP) açısından biyolojik olarak aktif olduğu gösterilmiştir. Son bir aşamada, kaplanmış skafold 85 ° C (T> T _trans) wh tedaviye ısıya maruz kaldığıIch yoğunlaşma scaffold yol açar. Isıl işlem, daha önce PCL kristal alanlar yakın yakınlık ¹⁴ yeniden düzenlenmesi, belki nedeniyle iskele şekil hafıza davranışı için önemli olduğu belirtilmişti.

Biz ayrıca, düzensiz bir model defekti içinde kendini uydurma davranışı karakterize açısından suş kontrollü halkalı-termal, mekanik sıkıştırma testleri bellek davranışı şekil (yani şekil kurtarma ve dinginlik şekil) yöntemlerini tarif morfoloji gözenek ve in vitro biyoetkinlikte. Iskele özelliklerini terzi Stratejiler de sunulmaktadır.

Protokol

1. sentezleme PCL-DA makromer

1. Açilleme reaksiyonu çalıştırın.
   1. Teflon kaplı manyetik karıştırma çubuğu ile donatılmış bir 250 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye PCL-diol _(Mn = ~ 10.000 g / mol) 20 g tartılır.
   2. DCM içinde PCL-diol içinde çözülür.
      1. Şişe 120 mLlof DCM ekle (yoğunluk = 0.17 g / ml).
      2. Ayrıca, DCM buharlaşmasını önler basınç artışını önlemek için şişenin boynuna gevşek bir lastik septum yerleştirin.
      3. ~ 250 rpm'de 30 dakika için karıştırın ~ Çözelti, polimerin çözünmesi için.
   3. Çözeltisine 4-dimetilaminopiridin (DMAP) ~ 6.6 mg eklenir ve karıştırılarak çözülür.
   4. Balonun boyun sıkıca lastik septum yerleştirin. Çözelti karıştırmaya devam etmesine izin.
   5. Lastik septum ile, yavaşça, bir pozitif azot basıncı ₂ iğne giriş, bir de açık bir iğne kullanılarak ~ 3 dakika _süreyle N2 ile tasfiye balonbir çıkış olarak.
   6. N ₂ giriş ve çıkışını sökün.
   7. Lastik septum içeri sokulan bir iğne ile donatılmış bir cam şırınga ile trietilamin 0.56 ml (4.0 mmol) (N Et ₃₎ damla damla ekleyin.
   8. Lastik septum içeri sokulan bir iğne ile donatılmış bir cam şırınga yoluyla, akriloil klorür damla damla 0,65 ml (8,0 mmol) ilave edilir.
   9. Şişeye _N2 girişi geri dönün ve içeriği ~ pozitif _N2 basıncı altında 30 dakika karışmaya bırakın.
   10. 55 ºC yağ banyosu önceden ısıtın.
   11. Ayrılan ~ 30 dakika sonra, _N2 girişi kaldırılır ve bir kondenser ile septum değiştirin.
   12. Önceden ısıtılmış bir yağ banyosu içine şişesi daldırın.
   13. Şişenin içindekiler, 20 saat boyunca karıştırılmaktadır.
   14. Ayrılan 20 saat sonra, yağ banyosundan çıkarın ve balon içeriği oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
   15. Bir dönen buharlaştıncı kullanarak şişeye DCM çözücüyü çıkarın.
2. PHam PCL-DA ürünü urify.
   1. Şişeye etil asetat ~ 135 ml ekleyin ve ham PCL-DA çözülür.
   2. Yerçekimi temiz bir 250 ml'lik yuvarlak dipli bir şişeye filtre kağıdından çözelti filtre edin. (Not: Çözüm kolayca geçerek değil, filtre kağıdı üzerinde kalınlaştırmak böylece, dikkatli bir ısıtma tabancası ile hafif ısı uygulayın.).
   3. Bir dönen buharlaştıncı kullanarak, şişeden çözücü etil asetatın ayrılması.
   4. Şişeye, ~ DCM 140 ml ilave edilir ve ham PCL-DA çözülür.
   5. 500 ml'lik bir ayırma hunisine aktarın.
   6. Huni için, 2 M potasyum _karbonat (3 K ₂ CO) 13.5 ml ekleyin.
   7. Huni Cap. Yavaşça vana aracılığıyla basınç serbest bırakmak için özen huni tersini hafifçe bir veya iki kez dönen iki katmanları karıştırın. 3 kez tekrarlayın.
   8. Parafilm bir tabaka ile Kapağı yerine yerleştirin ve kanşım O / N (~ 12 saat) ayırmak için izin verir.
   9. Dip toplayın, ya da250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içine Ganiç'in katmanı.
   10. Şişeye susuz magnezyum sülfat ~ 5 g (MgSO ₄₎ ekleyin ve yavaşça girdap.
   11. Yerçekimi yuvarlak tabanlı bir şişeye, nitel filtre kağıdı ile ve temiz 250 ml karışımı filtre.
   12. Bir dönen buharlaştıncı kullanarak şişeye DCM çözücüyü çıkarın.
   13. Yüksek vakum altında kuru kalıntı DCM kaldırın. (Not: PCL-DA ışıktan uzak muhafaza edilmelidir.)
   14. ^1H NMR ^22,23 ile Açilleme onaylayın.

SMP Scaffold hazırlanması 2. (Şekil 1)

1. Erimiş tuz şablonu hazırlayın.
   1. Çapı ~ 460 ± 70 um sodyum klorid (NaCl) partikülleri elde etmek için bir 425 um elek kullanın. (Not: Ortalama partikül büyüklüğü ImageJ yazılımı ile taramalı elektron mikroskobu [SEM] görüntülerden teyit edilebilir.) ¹⁴
   2. 3 ml bir cam şişe (J = 12,9 mm) için, daha önce elenmiş NaCI 1.8 g ekleyin.
   3. Yavaş yavaş şişeye dört kısım, ağırlık olarak% 7.5 (tuz ağırlığına dayalı olarak) DI su (0,146 g) içerisinde, ekleyin. Suyun her bir porsiyonunun eklenmesinden sonra metal bir spatula ile karıştırın.
   4. , Şişeyi Cap dokuda sarın ve bir santrifüj tüpüne dik yerleştirin. 3220 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
   5. Kapağını çıkarın ve hava-kuru O / N (~ 12 saat) izin verin.
2. Yeni bir cam şişe içinde, DCM ml'si başına PCL-DA 0.15 g birleştirerek bir "makromer çözüm" hazırlanması. (Not:., Bir iskele için, ~ çözeltinin 1 mi hazırlanmalıdır) kap ve yaklaşık 1 dakika boyunca vorteks mikserde yüksek hızda çözelti karıştırılır.
3. Yeni 3 ml bir cam şişe içinde, ağırlık olarak% 10 2,2-dimetoksi-2-fenil asetofenon 1-vinil-2-pirolidinon (DMP) (NVP) dayalı bir "foto-başlatıcı bir çözüm" hazırlanması. NVP 1 ml DMP 0.115 g 'ını. (Işığı engellemek için) alüminyum folyo ile sarın, Cap ve vorteks mikserde yüksek hızda çözüm karıştırmak: (180 ul gereklidir ~, tek iskele için. Not)~ 1 dakika karıştırıldı. (Not: Gelişmiş hazırlanmış, çözelti soğutulmuş ve ışıktan korunmalıdır.)
4. Alüminyum folyo ile (kapak hariç) makromer çözeltisi içeren vial Wrap (ışık bloke etmek için) ve pipet ile 15 hacim% ekleme foto-başlatıcı çözeltisi (makromer solüsyonunun toplam miktarına dayalı olarak). Cap ve yaklaşık 1 dakika boyunca vorteks mikserde yüksek hızda çözelti karıştırılır.
5. Alüminyum folyo ile (kap hariç) sigortalı tuz şablonu içeren flakon sarın (ışığı engellemek için) ve pipet aracılığıyla önceden hazırlanmış makromeri / photoinitiator çözüm eklemek (~ 0.6 ml veya şablon kadar tamamen kaplıdır).
6. , Şişeyi Cap dokuda sarın ve bir santrifüj tüpüne dik yerleştirin. Şablonun boyunca makromeri çözümü dağıtmak için 1260 xg'de 10 dakika boyunca santrifüj.
7. Alüminyum folyo çıkarın şişe kapağını açmak ve 3 dakika boyunca UV ışığı (365 nm, 25 W) maruz kalmaktadır. Hava kuru O / N.
8. "Tuz içeren scaffol kaldırpuanlama ve cam şişe üst çatlatma sonra cımbız ile şişeden d ".
9. (: 1 hacim: hacim 1) 400 ml'lik bir cam kaba, ~ çözücü, su / etanol 200 ml hazırlanır.
10. Günlük solvent değişiklikler ile 4 gün için çözücü, su / etanol içine daldırılmış iskele koruyun.
11. Solvent ve hava kuru O / N iskele çıkarın.

3. SMP Scaffold için Polydopamine Kaplama Uygulanması (Şekil 1)

1. Teflon kaplı karıştırma çubuğu ile donatılmış 400 ml'lik bir cam kaba, bir dopamin hidroklorür çözeltisi ~ 200 ml (10 mM Tris tamponu içinde 2 mg / ml, pH = 8,5, 25 ° C) hazırlanır. ~ 150 rpm'de karıştırılır.
2. Yarım mesafe iskelesi ile iskele içine ~; bir tek kullanımlık iğne (gösterge = 20 uzunluk = 40 mm) yerleştirin. Iğne hub etrafında bir tel sarın.
3. Beher kenarına tel tespit tarafından karıştırma dopamin çözeltisi içine (çözüm yüzeyi üzerinde iğne hub) ile iskele Batmak.
4. Iğne hub içine şırınga yerleştirerek ve iskele dışına havayı çekmek için bunu kullanarak iskele degas. (Not: daha fazla hava çıkarılabilir ve çözüm tamamen iskele sızmış zaman gazdan arındırma tamamlandı.)
5. 16 st için karıştırmadan dopamin solüsyonunda daldırılmış iskele koruyun.
6. Çözeltiden iskele çıkarın ve iğneyi çıkartın. 24 saat boyunca oda sıcaklığında bir vakumlu fırın içinde DI su ve kuru ile durulayın.
7. 1 saat 85 ºC fırında iskele yerleştirin.
8. Iskele oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Nihai silindirik iskele ~ 6 mm çap x ~ 5 mm yüksekliğinde olacak.

4. Değerlendirme "Kendinden uydurma" Davranış

1. Kalınlığı ~ 5 mm sert plastik bir levha kullanarak "düzensiz CMF kusur modeli" hazırlayın. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, ~ 6 mm'den biraz daha az bir ortalama çapa sahip plastik levha içindeki bir boşluğu oluşturmak için bir matkap kullanın.
2. Ab olarakEaker, ~ 60 ° C bir sıcaklığa kadar (tuzlu su klinik kullanımı temsil eden), ısı DI suyun.
3. Beher ~ 60 ºC su içine iskele yerleştirin. Su tüm alanları açığa, su yüzeyinin altında iskele itmek için cımbız kullanın. ~ 2 dakika boyunca veya iskele fark (Şekil 2B) yumuşayıncaya kadar devam edin.
4. Beher gelen iskele çıkarın ve hemen modeli defekt içine (elle) tuşuna basın.
5. RT (~ 5-10 dk) (Şekil 2C) soğumasını bekleyin.
6. Yeni sabit Geçici bir şekil ve nispeten daha bükülmez durumuna (Şekil 2D) dönüşünü gözlemlemek için bir kusur çıkar.

5. Test Şekil Hafıza Davranışı

1. Dinamik mekanik analizciyi kullanarak (DMA, burada kullanıldığı şekilde, örneğin bir TA Instruments Q800), iki döngü (N) şekil sabitliği _(Rf) belirlemek ve üzerinde bir platform üzerinde bir gerilme kontrollü siklik termal, mekanik sıkıştırma testiKurtarma (R _r) (Şekil 3) şekil.
   1. 5 dakika boyunca 60 ° C (T _yüksek) için dengelenmesi.
   2. % 50 / dakika maksimum gerilme (ε _m =% 50) sıkıştırır.
   3. Ε _{m (5} dk) tutun.
   4. 25 ° C (T _düşük) soğutulur ve 10 dakika Geçici bir şekil vermenin düzeltmek boyunca muhafaza edilir.
   5. Yükü alın.
   6. _(U ε) stressiz durumda nihai gerginlik ölçün.
   7. 60 ° C (T _yüksek) kadar yeniden ısıtın ve 10 dk kalıcı şekil kurtarmak için korumak.
   8. Kazanılan zorlanma (ε _p) ölçün.
   9. Hala (T _yüksek) 60 ° C'de, ^2. döngüsü başlatmak (N = 2) ^1. döngüden sonra kurtarıldı yüksekliği (N = 1)% 50 iskele sıkıştırarak iken.
   10. 5.1 Tekrar.3-5.1.8, N = 2.
   11. Aşağıdaki denklemler kullanılarak N = 1 ve 2 R ve R _{f r} hesaplayın:
       _Rf (N) = _[u ε (N) / ε _m] R _r (n) = [ε _{m -} ε _p (N)] / [ε _{m -} ε _p (N-1)]

6. görselleştirme Gözenek Boyutu ve Gözenek Bağlanırlığı bir

1. Tarama elektron mikroskobu kullanılarak (SEM; örneğin burada kullanıldığı şekliyle, bir FEI Quanta SEM), gözenek boyutu gözlemlemek ve birleştiricisi gözenek.
   1. Cımbız kullanarak, SMP iskele tutun 1 dakika boyunca _sıvı N 2 daldırın.
   2. Temiz bir jilet ile iskele ortasında boyunca sıvı _N2 ve kırık çıkarın.
   3. Karbon bandı kullanarak, numune üzerine SMP iskele yarım birini yapıştırmayınKırık yüzeyi yukarı bakacak şekilde sahneye.
   4. Au-Pt (~ 4 nm) ile ceket sputter.
   5. 10-15 kV (Şekil 4A) tavsiye edilen bir ivmelendirici gerilim SEM görüntüsünü yakalar.

In vitro biyoaktivitesi 7. Test

1. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine, ~ 1X SBF ^24, 30 ilave edin.
2. Orijinal, silindirik kalıplı kalıcı şekil bir iskele edinin. Temiz bir bıçak kullanarak (dairesel kenar boyunca) devre, iskele kesin.
3. Hazırlanan santrifüj tüpüne ve kapak içine ayrı bir iskele yarısını yerleştirin.
4. Herhangi bir SBF değişikliklerle, statik koşullar altında bir su banyosu içinde 37 ° C 'de muhafaza tüpü.
5. 14 gün sonra, 24 saat süre ile SBF ve kuru hava ile ilgili iskele çıkarın.
6. Karbon bandı kullanarak, kırık yüzeyi yukarı bakacak şekilde örnek sahneye iskele yapıştırın.
7. Au-Pt (~ 4 nm) ile ceket sputter.
8. Bir yeniden at SEM görüntü yakalamak10-15 kV (Şekil 4B) hızlanan gerilimi övdü.

Sonuçlar

Ortaya çıkan PCL tabanlı SMP iskele kendini saran bir model, CMF defekt içine (Şekil 2) yeteneğine sahiptir. Kısa süreli sonra tuzlu su (~ 60 ° C) ısıtmak için, silindirik bir skafold skafold elle bastırılması ve model kusur içinde genişler sağlayan yumuşatır. Oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, skafold kusur çıkarıldıktan sonra tutulan yeni geçici şekline sokuluşu sabitlenir.

Bir SMP skafoldun şekil belleği davranışı şekil sabitliğine...

Tartışmalar

Bu protokol, kendi kendine uyan davranışı bir polydopamine kaplı, PCL-bazlı yapı iskelesinin hazırlanmasını, hem de Osteoindüktivite kullanılabilirlik ve biyolojik aktivite tarif düzensiz CMF kemik defektlerinin tedavisinde yararlı hale getirir. Protokol Yönleri çeşitli iskele özelliklerini değiştirmek için değiştirilebilir.

Protokol UV kür izin vermek için bir PCL-diol Açilleme ile başlar. Bildirilen örnekte, PCL-diol _M n ~ 10.000 g / mol'dür. Bunu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Triethylamine (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Acryloyl chloride	Sigma-Aldrich	A24109
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
Potassium carbonate (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher	M65
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Dopamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	H8502
Tris buffer (2mol/L)	Fisher	BP1759	Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve	VWR	47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA)	TA Instruments	Q800
High Resolution Sputter Coater	Cressington	208HR
Scanning Electron Microscope (SEM)	FEI	Quanta 600