Fabrication d'une mémoire de forme "auto-ajustement" à base de PCL bioactifs, Polymer Échafaudages

Résumé

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Résumé

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Introduction

Actuellement considérée comme la norme de cranio-maxillo-faciale (CMF) traitements de défaut osseux or, la transplantation de greffons autologues récoltées est entravé par des procédures complexes de greffage, morbidité du site donneur et la disponibilité limitée ^1. Une difficulté particulière se dessine et fixant le autogreffe rigide étroitement dans le défaut afin d'obtenir l'ostéointégration et de prévenir la résorption du greffon. L'ingénierie tissulaire a été étudiée comme une stratégie alternative à autogreffe et substituts osseux synthétiques (par exemple de ciment osseux) ^2,3. Essentiel à la réussite d'une approche de l'ingénierie tissulaire est un échafaud avec un ensemble spécifique de propriétés. Tout d'abord, afin de parvenir à l'ostéointégration, l'échafaudage doit former un contact étroit avec le tissu osseux adjacent ^4. L'échafaudage doit également être ostéoconducteur, permettant la migration cellulaire, la diffusion des nutriments et ^4,5 neotissue dépôt. Ce comportement est généralement réalisé avec sca biodégradableffolds présentant un pore morphologie fortement interconnecté. Enfin, l'échafaudage doit être bioactif de manière à promouvoir l'intégration et la liaison avec le tissu osseux ⁵ environnante.

Ici, nous présentons un protocole pour préparer un échafaudage d'ingénierie tissulaire avec ces propriétés. Surtout, cette échafaudage présente la capacité de "l'auto-ajustement" dans des défauts CMF irrégulières en raison de sa forme le comportement de mémoire ^6. Thermosensible polymères à mémoire de forme (SMPS) sont connus pour subir un changement de forme lors de l'exposition à la chaleur ^7,8. PMC sont constitués de "NETPoints» (c.-à-reticulations chimiques ou physiques) qui déterminent la forme permanente et des "segments de commutation" qui maintiennent la forme temporaire et retrouver la forme permanente. Les segments de commutation présentent une température de transition thermique (T _trans) correspondant soit à la transition vitreuse (T _g) ou fondre transition (T _m) du polymère. CommeEn conséquence, les PMC peut être déformé de manière séquentielle dans une forme temporaire à T> _T trans, fixé dans la forme temporaire à T _{trans, et récupéré à la forme permanente à T> T trans. Ainsi, un échafaudage de SMP pourrait parvenir à "l'auto-ajustement" dans un défaut CMF comme suit ^6. Après exposition à réchauffer une solution saline (T> T trans), un échafaudage de SMP deviendrait malléable, permettant un échafaudage cylindrique générique prêt à être dans un défaut irrégulière pressé à la main, avec récupération de forme promouvoir l'expansion de l'échafaudage à la limite de défaut. Lors du refroidissement (T trans), l'échafaud reviendrait à son état ​​relativement plus rigide, avec la forme de fixité maintenir sa nouvelle forme temporaire au sein de la défectuosité. Dans ce protocole, un échafaudage de lait écrémé en poudre est préparée à partir de polycaprolactone (PCL), un polymère biodégradable a étudié intensivement pour la régénération des tissus et d'autres applications biomédicales ^9-11. Pour mémoire de forme, ee T m de PCL sert de T trans et varie entre 43 et 60 ° C, en fonction du poids moléculaire du ¹² PCL. Dans ce protocole, la T trans (c.-T m) de l'échafaudage est de 56,6 ± 0,3 ºC ^6.}

Afin d'atteindre ostéoconductivité, un protocole a été développé pour rendre échafaudages SMP à base de PCL avec des pores fortement interconnectés basés sur une méthode ^6,13,14 solvant coulée particules-lixiviation (SCPL). Le diacrylate de polycaprolactone (PCL-DA) (M _{n =} 10 000 ~ g / mol) a été utilisé pour permettre rapide, la reticulation photochimique et a été dissous dans du dichlorométhane (DCM) pour permettre au solvant de coulée sur le modèle de sel. Après la cure photochimique et l'évaporation du solvant, le modèle de sel a été éliminé par lessivage dans l'eau. La taille moyenne de sel régule la taille des pores échafaudage. Fait important, le gabarit de sel a été fusionné avec de l'eau avant le coulage de solvant pour obtenir pore interconnectiviTy.

La bioactivité a été conférée à l'échafaudage pour le SMP par la formation in situ d'un revêtement sur ​​polydopamine parois des pores ^6. La bioactivité est souvent introduit dans les échafaudages par l'inclusion de verre ou de vitrocéramique ^{de 15} charges. Toutefois, ceux-ci peuvent donner lieu à des propriétés mécaniques fragiles indésirables. La dopamine a été montré pour former une mince couche adhérente de polydopamine sur une variété de substrats ^16-19. Dans ce protocole, l'échafaudage pour SMP a été soumis à une solution légèrement basique (pH = 8,5) de la dopamine pour former un revêtement de nanothick de polydopamine sur toutes les surfaces de paroi des pores ^6. En plus d'améliorer l'hydrophilie de surface pour améliorer l'adhérence cellulaire et d'étalement, polydopamine a été montré pour être biologiquement actif sur le plan de formation d'hydroxyapatite (HAP) par exposition à un liquide corporel simulé (SBF) ^18,20,21. Dans une dernière étape, l'échafaud revêtu est exposé à un traitement thermique à 85 ° C (T> _T trans) which conduit à une densification échafaudage. Le traitement thermique a été noté précédemment comme essentiel pour le comportement à mémoire de forme d'échafaudage, peut-être en raison de domaines cristallins PCL se réorganiser pour une plus grande proximité ^14.

Nous décrivons en outre des méthodes pour caractériser le comportement d'auto-ajustement au sein d'un défaut de modèle irrégulier, façonner le comportement de la mémoire en ce qui concerne les tests de compression mécanique cyclique thermiques déformation contrôlée (par exemple reprise de forme et la forme de fixité), pore morphologie, et dans la bioactivité in vitro. Stratégies pour adapter les propriétés d'échafaudage sont également présentés.

Protocole

1. synthèse PCL-DA Macromère

1. Exécutez la réaction d'acrylation.
   1. Peser 20 g de PCL-diol (M _{n =} ~ 10 000 g / mol) dans 250 ml de ballon à fond rond équipé d'un barreau d'agitation magnétique téflon recouvert.
   2. Dissoudre le PCL-diol dans du DCM.
      1. Ajouter 120 mLlof DCM dans le ballon (concentration = 0,17 g / ml).
      2. Placer un septum en caoutchouc de façon lâche dans le col de la fiole de façon à éviter l'accumulation de pression tout en empêchant l'évaporation du DCM.
      3. Agiter la solution pendant environ 30 min à ~ 250 tours par minute pour dissoudre complètement le polymère.
   3. Ajouter ~ 6,6 mg de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) à la solution et dissoudre sous agitation.
   4. Placer un septum en caoutchouc solidement dans le col du flacon. Laisser la solution pour continuer l'agitation.
   5. A travers le septum en caoutchouc, purge doucement le ballon avec _N2 pendant ~ 3 min en utilisant une _arrivée de N2 de l'aiguille de pression positive et une aiguille ouvertecomme un exutoire.
   6. Retirer l'entrée N ₂ et la sortie.
   7. Ajouter 0,56 ml (4,0 mmoles) de triéthylamine _(Et3N) goutte à goutte via une seringue en verre équipé d'une aiguille insérée à travers le septum en caoutchouc.
   8. Ajouter 0,65 ml (8,0 mmoles) de chlorure d'acryloyle goutte à goutte via une seringue en verre équipé d'une aiguille insérée à travers le septum en caoutchouc.
   9. L'orifice d'entrée de retour N ₂ dans le ballon et permettent le contenu sous agitation sous pression positive _de N2 pendant environ 30 min.
   10. Préchauffer un bain d'huile à 55 ° C.
   11. Après la alloué ~ 30 min, retirez l'entrée N ₂ et remplacer le septum avec un condenseur.
   12. Immerger le ballon dans le bain d'huile préchauffé.
   13. Laisser le contenu du ballon sous agitation pendant 20 h.
   14. Après la alloué 20 h, enlever le ballon de bain d'huile et laisser le contenu refroidir à température ambiante.
   15. En utilisant un évaporateur rotatif, éliminer le solvant de la fiole DCM.
2. Purify le produit PCL-DA brut.
   1. Dans le ballon, ajouter ~ 135 ml d'acétate d'éthyle et on dissout le brut PCL-DA.
   2. Gravity filtrer la solution à travers un papier filtre dans un propres de 250 ml flacon à fond rond. (Remarque: Solution peut épaissir sur le papier filtre, pas facilement en passant par l'affirmative, appliquez soigneusement chaleur douce avec un pistolet de chauffage..)
   3. En utilisant un évaporateur rotatif, l'acétate d'éthyle enlever le solvant de la fiole.
   4. Pour le flacon, ajouter ~ 140 ml de DCM et de dissoudre le brut PCL-DA.
   5. Transférer le contenu à un 500 ml ampoule à décanter.
   6. Pour l'entonnoir, ajouter 13,5 ml de 2 M de carbonate de potassium (K ₂ CO _3).
   7. Cap l'entonnoir. Mélanger délicatement les deux couches en inversant l'entonnoir et remuant doucement une ou deux fois, en prenant soin de relâcher la pression par l'intermédiaire du robinet. Répétez 3 fois.
   8. Remplacer le bouchon d'une couche de Parafilm et laisser le mélange se séparer O / N (~ 12 h).
   9. Recueillir le fond, oucouche Ganic dans un Erlenmeyer de 250 ml.
   10. Ajouter ~ 5 g de sulfate de magnésium anhydre _(MgSÛ4) dans le ballon et agiter doucement.
   11. Masse filtrer le mélange à travers un papier-filtre qualitatif dans un récipient propre et 250 ml ballon à fond rond.
   12. En utilisant un évaporateur rotatif, éliminer le solvant de la fiole DCM.
   13. Sec sous vide poussé pour éliminer le DCM résiduel. (Remarque: PCL-DA doit être stockée à l'abri de la lumière.)
   14. Confirmez acrylation ^avec 1 H RMN ^22,23.

2. Préparation de la SMP Échafaudages (Figure 1)

1. Préparer le modèle de sel fondu.
   1. Utilisation d'un tamis de 425 um pour obtenir le chlorure de sodium (NaCl) 460 ± particules ~ 70 um de diamètre. (Note: La taille moyenne de particule peut être confirmée à partir de microscopie électronique à balayage [SEM] images avec le logiciel ImageJ.) ¹⁴
   2. Dans un ballon en verre de 3 ml (ID = 12,9 mm), ajouter 1,8 g de NaCl précédemment tamisée.
   3. Ajouter lentement, en quatre portions, 7,5% en poids (par rapport au poids de sel) de l'eau déminéralisée (0,146 g) à la fiole. Mélanger avec une spatule en métal après l'addition de chaque portion d'eau.
   4. Boucher le flacon, l'envelopper dans un tissu et le placer verticalement dans un tube de centrifugeuse. Centrifugeuse pendant 15 min à 3220 x g.
   5. Retirez le bouchon et laisser sécher à l'air O / N (~ 12 h).
2. Dans un nouveau flacon en verre, de préparer une "solution macromère" en combinant 0,15 g de PCL-DA par ml de DCM. (Note:. Pour un échafaudage, ~ 1 ml de solution doit être préparée) Cap et mélanger la solution à haute vitesse sur un vortex pour ~ 1 min.
3. Dans un nouveau flacon de 3 ml en verre, de préparer une "solution de photo-initiateur" sur la base de 10% en poids de 2,2-diméthoxy-2-phényl acétophénone (DMP) dans du 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP). Mélanger 0,115 g de DMP dans 1 ml de NVP. (Remarque: Pour un échafaudage, ~ 180 pi est requis.) Cap, envelopper dans du papier d'aluminium (pour bloquer la lumière) et mélanger la solution à haute vitesse sur un vortexpour ~ 1 min. (Remarque: Si préparé à l'avance, la solution doit être réfrigéré et protégé de la lumière.)
4. Envelopper le flacon contenant la solution de macromère (à l'exclusion du bouchon) d'une feuille d'aluminium (pour bloquer la lumière) et ajouter par pipette 15% en volume (sur la base du volume total de solution de macromère) de la solution de photoinitiateur. Cap et mélanger la solution à haute vitesse sur un vortex pour ~ 1 min.
5. Envelopper le flacon contenant le modèle de sel fondu (à l'exclusion du bouchon) avec une feuille d'aluminium (pour bloquer la lumière) et ajouter la solution via une pipette macromère / photo-initiateur préalablement préparé (~ 0,6 ml ou jusqu'à ce que le modèle est complètement recouverte).
6. Boucher le flacon, l'envelopper dans un tissu et le placer verticalement dans un tube de centrifugeuse. Centrifuger pendant 10 min à 1260 x g pour distribuer la solution de macromère tout au long de la matrice.
7. Retirer la feuille d'aluminium, décapsuler le flacon et d'exposer à la lumière UV (365 nm, 25 W) pendant 3 min. O-Air sec / N.
8. Retirez le "scaffol contenant du selD "de la fiole avec des pincettes après avoir marqué et fracture de la partie supérieure de la fiole de verre.
9. Dans un bécher de 400 ml, ~ préparer 200 ml d'un solvant eau / éthanol (1: 1 en volume: volume).
10. Maintenir l'échafaud immergé dans le solvant pendant 4 jours avec des changements quotidiens de solvant eau / éthanol.
11. Retirer l'échafaud du solvant et sécher à l'air O / N.

3. Appliquer Polydopamine Coating SMP Échafaudages (Figure 1)

1. Dans bécher de 400 ml équipé d'un barreau d'agitation en Teflon-couverte, préparer ~ 200 ml d'une solution de chlorhydrate de dopamine (2 mg / ml dans du tampon Tris 10 mM, pH = 8,5, 25 ° C). Agiter à ~ 150 rpm.
2. Placez une aiguille jetable (longueur = 40 mm; jauge = 20) dans l'échafaudage, ~ moitié de la distance grâce à l'échafaud. Enrouler un fil autour du moyeu de l'aiguille.
3. Immerger l'échafaud (avec le moyeu de l'aiguille au-dessus de la surface de la solution) dans la solution sous agitation de la dopamine par le fil d'ancrage sur le bord du gobelet.
4. Dégazer l'échafaud en plaçant une seringue dans le moyeu de l'aiguille et de l'utiliser pour aspirer l'air sur l'échafaud. (Note: Le dégazage est terminé lorsqu'il n'y a plus d'air peut être retiré et la solution a complètement infiltré le échafaud).
5. Maintenir l'échafaud immergé dans la solution de dopamine agitation pendant 16 heures.
6. Retirer l'échafaud de la solution et enlever l'aiguille. Rincer à l'eau DI et sec dans un four sous vide à température ambiante pendant 24 h.
7. Placez l'échafaud dans un four à 85 ºC pendant 1 heure.
8. Laisser l'échafaud refroidir à température ambiante. L'échafaudage cylindrique finale sera ~ 6 mm de diamètre x ~ 5 mm de hauteur.

4. évaluer le comportement "d'auto-ajustement"

1. Préparer un «modèle irrégulier de défaut CMF" à l'aide d'une feuille de plastique rigide dont l'épaisseur est de ~ 5 mm. Utilisation d'une perceuse pour créer un vide à l'intérieur de la feuille de matière plastique ayant un diamètre moyen un peu moins de ~ 6 mm, comme illustré dans la figure 2A.
2. Dans abEaker, de l'eau DI à la chaleur (ce qui représente l'utilisation clinique de sérum physiologique) à une température de 60 ° C ~.
3. Placez l'échafaud dans le bécher de ~ 60 ° C de l'eau. Utilisez des pinces pour pousser l'échafaud en dessous de la surface de l'eau, exposant tous les domaines de l'eau. Continuer pendant environ 2 min ou jusqu'à ce que l'échafaudage est sensiblement adoucie (figure 2B).
4. Retirer l'échafaud du bêcher et appuyez immédiatement (à la main) dans le défaut de modèle.
5. Laisser refroidir à température ambiante (~ 5-10 min) (Figure 2C).
6. Retirer du défaut d'observer la nouvelle, forme temporaire fixe et le retour de l'Etat relativement plus rigide (figure 2D).

5. Test de la mémoire de façonner le comportement

1. Utiliser un analyseur mécanique dynamique (DMA; par exemple, un TA Instruments Q800 comme utilisé ici), lancer un cyclique thermique test de compression mécanique souche contrôlée sur un échafaudage sur deux cycles (N) pour déterminer la forme de fixité (R _f) etfaçonner récupération (R _r) (Figure 3).
   1. Équilibrer à 60 ° C (T _élevé) pendant 5 min.
   2. Compresser à une souche maximale (ε _{m =} 50%) à 50% / min.
   3. Tenir à ε _m (5 min).
   4. Refroidir à 25 ° C (T _bas) et maintenir pendant 10 minutes pour fixer la forme temporaire.
   5. Retirer la charge.
   6. Mesurer la déformation à la rupture dans l'état sans stress (ε _u).
   7. Réchauffer à 60 ° C (T _haute) et maintenir pendant 10 min pour récupérer la forme permanente.
   8. Mesurer la souche récupéré (ε _p).
   9. Alors qu'il était encore à 60 ° C (T _élevé), ^démarrer le cycle de ^{Nd 2} (N = 2) par compression de l'échafaudage à 50% de la hauteur récupérée après ^la 1 ère cycles (N = 1).
   10. Répétez 5.1.3-5.1.8 Pour N = 2.
   11. Calculer _R f et R _r pour N = 1 et 2 en utilisant les équations suivantes:
       _R f (N) = [ε _{u (n)} / ε _{m] r} R (N) = [ε _m - ε _p (N)] / [ε _m - ε _p (N -1)]

6. Visualisation taille des pores et des pores interconnectivité

1. En utilisant la microscopie électronique à balayage (SEM; par exemple, une FEI Quanta SEM tel qu'utilisé ici), observer la taille des pores et des pores d'interconnexion.
   1. En utilisant des pinces pour maintenir l'échafaud de SMP, plonger dans de l'azote liquide ₂ pendant 1 min.
   2. Retirer du _N2 liquide et fracture le long du milieu de l'échafaudage avec une lame de rasoir propre.
   3. Avec du ruban de carbone, apposer l'une des moitiés SMP d'échafaudage sur l'échantillonscène avec la surface fracturée vers le haut.
   4. Pulvérisation manteau avec Au-Pt (~ 4 nm).
   5. Capturez l'image SEM à une tension d'accélération recommandée de 10-15 kV (figure 4A).

7. Test de la bioactivité in vitro

1. Dans un tube centrifuge de 50 ml, ajouter 30 ml de ~ 1X SBF ^24.
2. Obtenir un échafaudage dans sa forme permanente originale, cylindrique moulé. Couper l'échafaud de moitié (à travers le bord circulaire) en utilisant une lame propre.
3. Placez une demi-personne d'échafaudage dans le tube de centrifugeuse préparé et bouchon.
4. Maintenir le tube à 37 ° C dans un bain-marie dans des conditions statiques sans changement SBF.
5. Après 14 jours, retirez l'échafaud du SBF et l'air sec pendant 24 heures.
6. Avec du ruban de carbone, apposer l'échafaud sur la scène de l'échantillon avec la surface fracturée vers le haut.
7. Pulvérisation manteau avec Au-Pt (~ 4 nm).
8. Capturez l'image MEB à un refélicité tension d'accélération de 10-15 kV (figure 4B).

Résultats

L'échafaudage de SMP à base de PCL résultant est capable d'auto-montage dans un modèle CMF défaut (Figure 2). Après une brève exposition à chauffer une solution saline (~ 60 ° C), l'échafaud cylindrique adoucit permettant l'échafaud pour être pressé manuellement dans et d'élargir l'intérieur du défaut de modèle. Après refroidissement à TA, l'échafaudage est fixé dans sa nouvelle forme temporaire qui est retenu lors de l'élimination du défaut.

Discussion

Ce protocole décrit la préparation d'un échafaudage à base de PCL polydopamine revêtue dont l'auto-ajustage comportement, ainsi que ostéoinductivité et la bioactivité, il est d'intérêt pour le traitement de défauts osseux irréguliers FMC. Les aspects du protocole peuvent être modifiés pour modifier diverses caractéristiques d'échafaudage.

Le protocole commence par acrylation d'un PCL-diol pour permettre la guérison UV. Dans l'exemple indiqué, la PCL-...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Triethylamine (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Acryloyl chloride	Sigma-Aldrich	A24109
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
Potassium carbonate (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher	M65
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Dopamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	H8502
Tris buffer (2mol/L)	Fisher	BP1759	Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve	VWR	47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA)	TA Instruments	Q800
High Resolution Sputter Coater	Cressington	208HR
Scanning Electron Microscope (SEM)	FEI	Quanta 600