Изготовление биоактивными, PCL основе "Self-установки" памятью формы полимеров Scaffold

Резюме

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Аннотация

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Введение

В настоящее время считается золотым стандартом черепно-челюстно-лицевой (CMF) костный дефект лечения, трансплантация аутологичных добываемых трансплантатов затруднено сложными процедурами прививки, донор сайте заболеваемости и ограниченная доступность ^1. Особая сложность формирует и фиксации жесткого аутотрансплантата плотно в дефект, чтобы получить остеоинтеграции и предотвратить резорбцию трансплантата. Тканевая инженерия была исследована в качестве альтернативной стратегии, чтобы аутотрансплантации и синтетических заменителей кости (например, кости цемент) ^2,3. Решающее значение для успеха тканевой инженерии подхода является каркас с определенным набором свойств. Во-первых, для достижения остеоинтеграции, подмости должны образовывать тесные контакты с рядом костной ткани ^4. Леса должны быть остеокондуктивный, позволяя миграцию клеток, питательную диффузии и neotissue ^4,5 осаждения. Такое поведение, как правило, достигается с биоразлагаемой SCAffolds демонстрируя высокую взаимосвязанную морфологию пор. Наконец, каркас должен быть биологически активным, с тем чтобы содействовать интеграции и связей с окружающей костной ткани ^5.

Здесь мы приводим протокол для подготовки тканевой инженерии эшафот с этими свойствами. Важно отметить, что это эшафот проявляет способность к "само-подходят" в нерегулярных CMF дефекты, связанные с его поведением с памятью формы ^6. Thermoresponsive полимеры с памятью формы (SMPS), как известно, проходят под воздействием изменения формы, чтобы нагреть ^7,8. У SMP состоят из "netpoints» (то есть химических или физических сшивок), которые определяют постоянную форму и "переключение" сегменты, которые поддерживают временную форму и восстановить постоянную форму. Сегменты переключения проявляют тепловой температуру перехода (Т _транс), соответствующую либо стеклования (T _G) или переход (Т _м) в расплав полимера. В видерезультат, бухгалтерские фирмы может быть последовательно деформированы во временную форму при Т> Т _транс, фиксированной в форме временного при Т <Т _транс, и восстановились до постоянной форме при Т> Т _транс. Таким образом, СМП леса может достичь "само-фитинг" в дефекта CMF следующим ^6. После экспозиции, чтобы нагреть раствор (Т> Т _транс), многопроцессорной леса станет податливым, разрешая общем подготовленные цилиндрические эшафот, чтобы быть ручной нажата в неправильной дефекта, с восстановление формы поощрения расширения эшафот с дефектом границы. После охлаждения (T транс), подмости бы вернуться к своей относительно более жесткой состоянии, с форма устойчивость поддержания своего нового временную форму в дефекта. В этом протоколе, многопроцессорной каркас изготовлен из поликапролактон (PCL), биоразлагаемый полимер изучена для регенерации тканей и других биомедицинских приложений ^9-11. Для памятью формы, тысе Т _м PCL служит Т _транс и колеблется в пределах 43 ° С и 60, в зависимости от молекулярной массы PCL ^12. В этом протоколе, Т _{транс (т.е.} Т _м) от помост 56,6 ± 0,3 ° С ^6.

Для достижения Остеокондуктивность, был разработан протокол, чтобы SMP каркасов PCL на основе с высоко взаимопроникающих пор, основанный на методе ^6,13,14 растворителем литья частиц выщелачивания (SCPL). Поликапролактон диакрилат (PCL-DA), (М _{п =} ~ 10000 г / моль) был использован для обеспечения быстрого, фотохимической сшивки и растворяли в дихлорметане (ДХМ), чтобы позволить растворителей литье по шаблону соли. После фотохимического отверждения и испарения растворителя, шаблон соль удал выщелачивания в воду. Средний размер соль регулирует размер эшафот пор. Важно отметить, что шаблон соли сливают с водой перед растворитель под давлением, чтобы достичь пор interconnectiviТай.

Биологическая был придана SMP эшафот К в формировании месте в в polydopamine покрытия на стенки пор ^6. Биологическая часто вводят в каркасах включением стеклянных или стеклокерамических наполнителей ^15. Тем не менее, это может привести к нежелательным хрупких механических свойств. Допамин, как было показано, чтобы сформировать клейкий тонкий слой на polydopamine различных субстратов ^16-19. В этом протоколе, СМП каркас был подвергнут слабощелочной раствор (рН = 8,5) дофамина с образованием nanothick покрытие polydopamine на всех поверхностях стенки поры ^6. В дополнение к повышению гидрофильности поверхности для улучшения адгезии клеток и распространение, polydopamine было показано, что биологически активный в отношении образования гидроксиапатита (ГАП) при воздействии имитаторе жидкости тела (SBF) ^18,20,21. На последнем этапе, подмости покрытием подвергается термообработке при 85 ºC (Т> Т _транс) WHIch приводит к уплотнению эшафот. Термообработка ранее отметил, что важное значение для поведения форма эшафот памяти, возможно, из-за PCL кристаллические домены реорганизации в большей близости ^14.

Мы дополнительно описать методы, чтобы охарактеризовать собственного облегающие поведение в неправильной модели дефекта, форма поведения памяти в терминах деформации управлением циклического тепловых испытаний механического сжатия (т.е. восстановление формы и формы неподвижность), морфологию пор, а в пробирке биологической. Стратегии Портной свойства эшафот также представлены.

протокол

1. синтезирующий PCL-DA Макромер

1. Запустите реакцию acrylation.
   1. Взвешивают 20 г PCL-диола _(М н = ~ 10000 г / моль) в 250 мл круглодонную колбу, снабженную тефлоновой покрытой магнитной мешалкой.
   2. Растворите PCL-диола в DCM.
      1. Добавить 120 mLlof DCM в колбу (концентрации = 0,17 г / мл).
      2. Поместите резиновой пробкой свободно в горло колбы таким образом, чтобы избежать роста давления в то же время предотвращая испарение DCM.
      3. Перемешать раствор в течение ~ 30 мин при 250 оборотах в минуту ~ до полного растворения полимера.
   3. Добавить ~ 6,6 мг 4-диметиламинопиридина (ДМАП) в раствор и растворить при перемешивании.
   4. Поместите резиновой пробкой надежно в горло колбы. Разрешить решение, чтобы продолжить перемешивание.
   5. Через резиновую прокладку, аккуратно очистить колбу с N ₂ за ~ 3 мин с помощью положительного N ₂ вход иглы давление и открытый иглув качестве выхода.
   6. Снимите впускной N _{2 и} выход.
   7. Добавить 0,56 мл (4,0 ммоль) триэтиламина (Et ₃ N) по каплям через стеклянный шприц, снабженный иглой, вставленной в резиновое перегородки.
   8. Добавить 0,65 мл (8,0 ммоль) по каплям акрилоилхлорида с помощью стекл нным шприцем, снабженный иглой, вставленной в резиновое перегородки.
   9. Вернуться вход N ₂ в колбу и позволяют содержимое размешать при положительном давлении _N 2 за ~ 30 мин.
   10. Предварительно разогрейте масляную ванну до 55 ° C.
   11. После отведенного ~ 30 мин, снимите впускной N ₂ и заменить перегородку с конденсатором.
   12. Погрузите колбу в масляной ванне предварительно нагретой.
   13. Разрешить содержимое колбы перемешивают в течение 20 ч.
   14. После 20 часов отведенное, удалить колбу из масляной бани и позволяют охладиться содержимое, до комнатной температуры.
   15. С использованием роторного испарителя, удалить растворитель ДХМ из колбы.
2. пurify сырой продукт PCL-DA.
   1. В колбу, добавить ~ 135 мл этилацетата и растворить неочищенный PCL-DA.
   2. Гравитация фильтровать раствор через фильтровальную бумагу в чистую 250 мл круглодонную колбу. (Примечание: решение может загустеть на фильтровальной бумаге, не всегда проходящий через Если это так, тщательно применять умеренный нагрев нагревательным пистолетом.).
   3. С использованием роторного испарителя, удалить этилацетат растворитель из колбы.
   4. В колбу, добавить ~ 140 мл ДХМ и растворить неочищенный PCL-DA.
   5. Передача содержимого с 500 мл делительную воронку.
   6. К воронке, добавить 13,5 мл 2 М карбоната калия (K ₂ CO _3).
   7. Закрывают воронку. Аккуратно перемешать два слоя путем обращения воронку и осторожно вращая один или два раза, заботясь, чтобы выпустить давление через запорный кран. Повторите 3 раза.
   8. Установите крышку со слоем парафильмом и дают смеси, чтобы отделить O / N (~ 12 ч).
   9. Соберите дна, илиГанич слой в колбу Эрленмейера на 250 мл.
   10. Добавить ~ 5 г безводным сульфатом магния (MgSO ₄₎ В колбу, и нежно вихревой.
   11. Плотность смесь фильтруют через фильтровальную бумагу качественного и в чистую 250 мл круглодонную колбу.
   12. С использованием роторного испарителя, удалить растворитель ДХМ из колбы.
   13. Сухой под высоким вакуумом, чтобы удалить остатки DCM. (Примечание: PCL-DA следует хранить в защищенном от света).
   14. Подтвердите acrylation с ¹ H ЯМР ^22,23.

2. Подготовка SMP строительные леса (рис 1)

1. Подготовка слитый шаблон соль.
   1. Использование 425 мкм сито, чтобы получить хлорид натрия (NaCl) частиц ~ 460 ± 70 мкм в диаметре. (Примечание: Средний размер частиц может быть подтверждена из сканирующей электронной микроскопии [СЭМ] изображений с ImageJ программного обеспечения.) ¹⁴
   2. В стеклянный флакон 3 мл (ID = 12,9 мм), добавьте 1,8 г просеянного ранее NaCl.
   3. Медленно добавить, четырьмя порциями, 7,5 мас% (в расчете на массу соли) деионизированной воды (0,146 г) в пробирку. Смешать с помощью металлического шпателя после добавления каждой порции воды.
   4. Пробирку закрывают, завернуть в ткань и поместить вертикально в центрифужную пробирку. Центрифуга течение 15 мин при 3220 х г в.
   5. Снимите крышку и дайте высохнуть на воздухе O / N (~ 12 ч).
2. В новом стеклянном флаконе, подготовить "макромера решение" путем объединения 0,15 г PCL-DA на мл DCM. (Примечание:. Для одного эшафот, ~ 1 мл раствора должна быть подготовлена) Крышка и перемешать раствор на высокой скорости на вихревом смесителе в течение ~ 1 мин.
3. В новом стеклянный флакон 3 мл, подготовить "фотоинициатора решение" на основе 10% -ного 2,2-диметокси-2-фенил ацетофенон (DMP) в 1-винил-2-пирролидинона (НВП). Комбинат 0,115 г DMP в 1 мл НВП. (Примечание: Для одного эшафот, ~ 180 мкл требуется.) Cap, обернуть алюминиевой фольгой (чтобы блокировать свет) и перемешать раствор на высокой скорости на вихревом смесителев течение ~ 1 мин. (Примечание: Если подготовлен в передовой, решение должно быть в холодильнике и защищен от света).
4. Заверните флакон, содержащий раствор макромера (за исключением крышки) с алюминиевой фольгой (блокировать свет) и добавить через пипетку 15% по объему (на основе общего объема раствора) макромера фотоинициатора раствора. Крышка и перемешать раствор на высокой скорости на вихревом смесителе в течение ~ 1 мин.
5. Оберните ампулу, содержащую расплавленный шаблон соль (кроме крышки) с алюминиевой фольгой (чтобы блокировать свет) и добавить с помощью пипетки ранее подготовленный раствор макромер / фотоинициатора (~ 0,6 мл или до тех пор, пока шаблон полностью покрыта).
6. Пробирку закрывают, завернуть в ткань и поместить вертикально в центрифужную пробирку. Центрифуга течение 10 мин при 1260 х г распределить макромера растворе в течение всего шаблона.
7. Снимите фольгу, Открывать флакон и подвергать УФ-излучения (365 нм, 25 Вт) в течение 3 мин. Воздух сухой O / N.
8. Снимите "содержащей соль scaffold "из флакона с помощью пинцета после выигрыша и разрыва в верхней части стеклянный флакон.
9. В 400 мл стакане, готовят ~ 200 мл смеси вода / этанол растворителей (1: 1 по объему: объем).
10. Поддержание каркас погружен в вода / этанол растворителей в течение 4 дней с ежедневных изменений растворителей.
11. Снимите каркас из растворителя и воздушно-сухой O / N.

3. Применение Polydopamine покрытие для SMP строительные леса (рис 1)

1. В 400 мл химический стакан, снабженный тефлоновым покрыта мешалкой, готовят ~ 200 мл раствора гидрохлорида допамина (2 мг / мл в 10 мМ трис-буфера, рН = 8,5, 25 ° C). Движение на ~ 150 оборотов в минуту.
2. Поставьте одноразовую иглу (длина = 40 мм; калибр = 20) в эшафоте, ~ половина расстояния через эшафот. Оберните проволоку вокруг втулки иглы.
3. Погрузите каркас (с втулки иглы над поверхностью раствора) в растворе перемешивание допамина анкерными провод к краю стакана.
4. Дегазации каркас путем размещения шприца во втулку иглы и использовать его, чтобы вытащить воздух из помост. (Примечание: Дегазация завершается, когда нет больше воздуха не могут быть удалены, а решение полностью проникли на эшафот.)
5. Поддержание каркас погружен в раствор с перемешиванием дофамина в течение 16 часов.
6. Извлеките каркас из раствора и удалить иглу. Промыть дистиллированной водой и сушат в вакуумной печи при комнатной температуре в течение 24 ч.
7. Поместите каркас в 85 ºC духовку на 1 час.
8. Дайте каркас остыть до комнатной температуры. Окончательный цилиндрический каркас будет ~ диаметром 6 мм х ~ 5 мм высота.

4. Оценка "Self-установки" Поведение

1. Подготовка "неправильную CMF дефектов модель", используя лист жесткого пластика, толщина которого составляет ~ 5 мм. С помощью сверла, чтобы создать вакуум внутри пластикового листа со средним диаметром немного меньше, чем ~ 6 мм, как показано на фиг.2А.
2. В АВEaker, тепло деионизированной воды (представляющий клиническое использование солевой раствор) до температуры ~ 60 ° C.
3. Поместите каркас в стакан ~ 60 ° С воды. Используйте пинцет, чтобы нажать на эшафот под поверхностью воды, обнажая все области к воде. Продолжайте ~ 2 мин или до леса заметно смягчился (рис 2B).
4. Извлеките каркас из стакана и сразу нажмите (вручную) в модели дефекта.
5. Дают остыть до комнатной температуры (~ 5-10 мин) (фиг.2с).
6. Удалить из дефекта наблюдать новый, фиксированный временную форму и возвращение в относительно более жесткой положении (фигура 2D).

5. Тестирование Поведение памятью формы

1. Использование динамического механического анализатора (DMA, например: в ТА Instruments Q800, используемый здесь), выполнить циклический-термомеханической деформации сжатия тест управлением на леске более двух циклов (N) для определения формы неподвижность (R _F) иформировать восстановление _(R R) (Рисунок 3).
   1. Равновесие при 60 ° С (Т) _{большой} в течение 5 мин.
   2. Сжатие до максимальной деформации ε _{(т =} 50%) при 50% / мин.
   3. Держите на е _м (5 мин).
   4. Остудить до 25 ° С (Т) _{с низким} и поддерживать в течение 10 мин, чтобы исправить временную форму.
   5. Снимите нагрузку.
   6. Измерьте максимальную нагрузку в свободной от стрессов состояние (е _U).
   7. Reheat до 60 ° С (Т) _{большой} и поддерживать в течение 10 мин, чтобы восстановить постоянную форму.
   8. Измерьте напряжение восстановленную (ε _р).
   9. В то время как еще в 60 ° C (T) _{высокой,} начать ^й цикл 2 (N = 2), сжимая эшафот до 50% от высоты восстановленного после ^1-го цикла (N = 1).
   10. Повторите 5.1.3-5.1.8 Для N = 2.
   11. Рассчитать _R F и _R R для N = 1 и 2 с использованием следующих уравнений:
       _R F (N) = [ε _{U (N)} / ε _{м] R} R (N) = [ε _м - ε _{P (N)]} / [ε _м - ε _{P (N} -1)]

6. Визуализация Размер пор и пор Взаимосвязанность

1. Использование сканирующей электронной микроскопии (SEM; например FEI Quanta SEM, как используется здесь), наблюдать за размер пор и поры взаимосвязанность.
   1. С помощью пинцета держать SMP эшафот, погрузить в жидкий _N 2 в течение 1 мин.
   2. Удалить из жидкого _N 2 и разрушения вдоль середины помост с чистой лезвие бритвы.
   3. Использование углерода ленту, прикрепите один из СМП лесов половинки на образецЭтап с перелом поверхностью вверх.
   4. Sputter пальто с Au-Pt (~ 4 нм).
   5. Захват изображения SEM по рекомендованной ускоряющим напряжением 10-15 кВ (рис 4а).

7. Тестирование биологической активности в пробирке

1. В 50 мл центрифужную пробирку, добавляют ~ 30 мл SBF 1X ^24.
2. Получить эшафот в своем первоначальном, цилиндрической формы литьевые постоянного. Отрежьте леску пополам (поперек круговой кромки), используя чистую лезвие.
3. Поместите индивидуальный эшафот половину в подготовленную пробирку для центрифугирования и крышки.
4. Поддержание трубку при 37 ° С на водяной бане в статических условиях без каких-либо изменений SBF.
5. После 14 дней, удалить эшафот из SBF и сухой воздух в течение 24 часов.
6. Использование углерода ленту, закрепите леску на стадии образца с перелом поверхностью вверх.
7. Sputter пальто с Au-Pt (~ 4 нм).
8. Захват изображения SEM в реоценил ускоряющее напряжение 10-15 кВ в (рис 4В).

Результаты

В результате PCL на основе СМП леса способен себя облегающие модели в CMF дефекта (рис 2). После кратковременной нагреваться физиологический раствор (~ 60 ° C), цилиндрический каркас смягчает позволяя каркас быть вручную нажата в течение и расширить модели дефекта. После охлаждения ?...

Обсуждение

Этот протокол описывает подготовку polydopamine покрытием, PCL основе эшафот, чьи самостоятельно установки поведения, а также остеоиндуктивность и биологическую активность, делает его интерес в лечении нерегулярных CMF костных дефектов. Аспекты протокола может быть изменен, чтобы изменить ра...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Triethylamine (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Acryloyl chloride	Sigma-Aldrich	A24109
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
Potassium carbonate (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher	M65
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Dopamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	H8502
Tris buffer (2mol/L)	Fisher	BP1759	Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve	VWR	47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA)	TA Instruments	Q800
High Resolution Sputter Coater	Cressington	208HR
Scanning Electron Microscope (SEM)	FEI	Quanta 600