Fabricação de uma baseada em PCL Bioativos, "Self-fitting" Memória de Forma Polymer Andaime

Resumo

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Resumo

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Introdução

Atualmente considerada o padrão ouro do crânio-maxilo-facial (CMF) Tratamentos de defeito ósseo, o transplante de enxerto autólogo colhido é prejudicado por procedimentos de enxerto complexos, área doadora morbidade e disponibilidade limitada ^1. Uma dificuldade particular está a moldar e que fixa o auto-enxerto rígida firmemente no defeito de modo a obter a osteointegração e para evitar a reabsorção do enxerto. A engenharia de tecidos tem sido investigado como uma estratégia alternativa a auto-enxertia e substitutos ósseos artificiais (por exemplo, cimento ósseo) ^2,3. Crítica para o sucesso de uma abordagem de engenharia de tecidos é um andaime com um conjunto específico de propriedades. Em primeiro lugar, a fim de alcançar a osteointegração, o andaime deve formar um contacto estreito com o tecido ósseo adjacente ^4. O andaime também deve ser osteocondutor, permitindo a migração celular, difusão de nutrientes e neotissue ^4,5 deposição. Este comportamento é geralmente conseguida com sca biodegradávelffolds exibindo uma morfologia de poro altamente interligada. Por último, o andaime deve ser bioativa, de modo a promover a integração e ligação com áreas de tecido ósseo ^5.

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar um andaime engenharia de tecidos com estas propriedades. Importante, este andaime exibe a capacidade de "auto-ajuste" em CMF irregulares defeitos, devido ao seu comportamento com memória de forma ^6. Polímeros com memória de forma Thermoresponsive (SMPS) são conhecidos por sofrerem alteração da forma, por exposição ao calor ^7,8. SMPs são compostas de "pontos de Netpoint" (isto é ligações cruzadas físicas ou químicas) que determinam a forma permanente e "segmentos de comutação" que mantêm a forma temporária e recuperar a forma permanente. Os segmentos de comutação exibem uma temperatura de transição térmica (t _trans) correspondente, quer ao de transição vítrea _(Tg) de transição ou fusão _(Tm) do polímero. Comoresultado, SMPs pode ser deformado sequencialmente em uma forma temporária no T> T _trans, fixado na forma temporária no T trans, e recuperou-se à forma permanente no T> T _trans. Assim, um andaime SMP poderia conseguir "auto-ajuste" dentro de um defeito CMF da seguinte ^6. Após a exposição a aquecer salina (T> T _trans), um andaime SMP iria se tornar maleável, permitindo uma cilíndrico andaime genericamente preparado para ser em um defeito irregular mão-pressionado, com recuperação de forma promovendo a expansão do andaime para o limite defeito. Com o arrefecimento (T trans), o andaime voltaria ao seu estado relativamente mais rígida, com forma fixidez manter sua nova forma temporária dentro do defeito. Neste protocolo, um andaime SMP é preparado a partir de policaprolactona (PCL), um polímero biodegradável estudado extensivamente para a regeneração de tecidos e outras aplicações biomédicas ^9-11. Para memória de forma, thE T _{M de} PCL serve como a _trans t e varia entre 43 e 60 ° C, dependendo do peso molecular do PCL ^12. Neste protocolo, o T _trans (ou seja, T _m) do andaime é 56,6 ± 0,3 ºC ^6.

A fim de alcançar osteocondutividade, foi desenvolvido um protocolo para fazer andaimes SMP baseados em PCL com poros altamente interligados com base num método de fundição ^{6,13,14-solvente} partículas de lixiviação (SCPL). Diacrilato de policaprolactona (PCL-DA) (M = _N ~ 10000 g / mol) foi utilizado para permitir a rápida, reticulação fotoquímica e foi dissolvido em diclorometano (DCM) para permitir-solvente sobre o molde de fundição de sal. Após cura fotoquímica e evaporação do solvente, o molde sal foi removido por lixiviação em água. O tamanho médio de sal regula o tamanho de poro andaime. Mais importante, o modelo de sal foi fundido com água antes de o solvente de fundição para alcançar poro interconnectivity.

A bioactividade foi conferida ao andaime SMP pela formação in situ de um revestimento nas paredes dos poros polydopamine ^6. A bioactividade é frequentemente introduzido no andaimes pela inclusão de vidro ou de vidro cerâmico de enchimento ^15. Contudo, estes podem dar origem a propriedades mecânicas indesejadas quebradiças. A dopamina tem sido mostrado para formar, uma camada aderente fina polydopamine em uma variedade de substratos ^16-19. Neste protocolo, o andaime PMS foi submetido a uma solução ligeiramente básica (pH = 8,5) de dopamina para formar um revestimento de polydopamine nanothick em todas as superfícies de parede do poro ^6. Além de aumentar a hidrofilicidade da superfície para melhorar a adesão e espalhamento, polydopamine tem sido mostrado para ser bioactivo em termos de formação de hidroxiapatite (HAp) após exposição ao fluido corporal simulado (SBF) ^18,20,21. Num último passo, o andaime revestido é exposto a um tratamento térmico a 85 ° C (T> T _trans) WHich leva a scaffold densificação. O tratamento térmico foi observado anteriormente a ser essencial para o comportamento de memória de forma andaime, talvez devido a domínios cristalinos PCL reorganizando a maior proximidade ^14.

Nós descrevemos adicionalmente os métodos para caracterizar o comportamento de auto-montagem dentro de um defeito modelo irregular, moldar o comportamento de memória em termos de ensaios de compressão mecânica cíclico térmicos com deformação controlada (isto é, recuperação da forma e moldar fixidez), morfologia de poros, e de bioactividade in vitro. São também apresentadas estratégias para adequar propriedades de andaime.

Protocolo

1. Sintetizando PCL-DA Macrómero

1. Execute a reação acrylation.
   1. Pesar 20 g de PCL-diol (M _n = ~ 10000 g / mol) em frasco de 250 ml de fundo redondo equipado com uma barra de agitação magnética coberta de teflon.
   2. Dissolve-se o PCL-diol em DCM.
      1. Adicionar 120 mLlof DCM para o frasco (concentração = 0,17 g / ml).
      2. Coloque um septo de borracha frouxamente dentro do gargalo do frasco de modo a evitar a acumulação de pressão enquanto também previne a evaporação do DCM.
      3. Solução agitar durante ~ 30 min a ~ 250 rpm, para dissolver completamente o polímero.
   3. Adicionar ~ 6,6 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) à solução e dissolver sob agitação.
   4. Coloque um septo de borracha de forma segura no gargalo do frasco. Permitir que a solução de continuar a agitação.
   5. Através do septo de borracha, limpar suavemente o frasco com _N2 durante ~ 3 min usando uma _entrada de N2 positiva agulha e uma agulha de pressão abertacomo uma saída.
   6. Remover a _entrada de N2 e de saída.
   7. Adicionar 0,56 ml (4,0 mmol) de trietilamina _(Et3N) gota a gota através de uma seringa de vidro equipada com uma agulha introduzida através do septo de borracha.
   8. Adicionar 0,65 ml (8,0 mmol) de cloreto de acriloílo, gota a gota através de uma seringa de vidro equipada com uma agulha introduzida através do septo de borracha.
   9. E volta a _uma entrada de N2 ao balão e permitir que o conteúdo a agitar sob pressão positiva _de N2 durante ~ 30 min.
   10. Pré-aquecer num banho de óleo a 55 ° C.
   11. Após o atribuído ~ 30 min, remover a _entrada de N2 e substituir o septo com um condensador.
   12. Mergulhe o balão no banho de óleo pré-aquecido.
   13. Deixar o conteúdo do balão em agitação durante 20 h.
   14. Após 20 h a alocado, retirar o balão do banho de óleo e permite que o conteúdo arrefecer até à TA.
   15. Usando um evaporador rotativo, remover o solvente DCM a partir do frasco.
2. Purify o produto em bruto PCL-DA.
   1. Ao balão, adicionar ~ 135 ml de acetato de etilo e dissolve-se o produto em bruto PCL-DA.
   2. Gravidade filtrar a solução através de papel de filtro para um balão de fundo redondo de 250 ml limpo. (Nota: A solução pode engrossar no papel de filtro, não prontamente passar através Se assim for, cuidadosamente aplicar calor suave com uma pistola de aquecimento.).
   3. Usando um evaporador rotativo, remover solvente acetato de etilo a partir do frasco.
   4. Ao balão, adicionar ~ 140 ml de DCM e dissolver o produto em bruto PCL-DA.
   5. Transferir o conteúdo para um funil de separação de 500 mL.
   6. Para o funil, adicionar 13,5 mL de carbonato de potássio 2 M (K ₂ CO _3).
   7. Tapar o funil. Misture delicadamente as duas camadas, invertendo o funil e rodando suavemente uma ou duas vezes, tomando cuidado para liberar a pressão através da torneira. Repita 3 vezes.
   8. Substituir a tampa com uma camada de Parafilm e permitir que a mistura para separar S / N (~ 12 h).
   9. Colete o fundo, oucamada gânica para um balão de Erlenmeyer de 250 mL.
   10. Adicionar ~ 5 g de sulfato de magnésio anidro _(MgSO4) ao balão e agitar suavemente.
   11. Gravidade filtrar a mistura através de papel filtro qualitativo e em um ambiente limpo 250 ml balão de fundo redondo.
   12. Usando um evaporador rotativo, remover o solvente DCM a partir do frasco.
   13. Seca-se sob alto vácuo para remover o DCM residual. (Nota: PCL-DA devem ser armazenados longe da luz.)
   14. Confirme acrylation com ^{1H NMR 22,23.}

2. Preparar o SMP Andaime (Figura 1)

1. Prepare o modelo de sal fundido.
   1. Use de um peneiro de 425 | iM para se obter cloreto de sódio (NaCl) 460 ~ partículas ± 70 um de diâmetro. (Nota: O tamanho médio de partícula pode ser confirmado a partir de microscopia eletrônica de varredura [SEM] imagens com o software ImageJ.) ¹⁴
   2. Para um frasco de vidro de 3 ml (ID = 12,9 mm), adicionar 1,8 g de NaCl previamente peneirado.
   3. Adiciona-se lentamente, em quatro porções, 7,5% em peso (com base no peso de sal) água Dl (0,146 g), para o frasco. Misturar com uma espátula de metal, após a adição de cada porção de água.
   4. Tapar o frasco, enrole em tecido e colocar na vertical num tubo de centrifugação. Centrifugar durante 15 minutos a 3220 x g.
   5. Retire a tampa e deixe secar ao ar O / N (~ 12 horas).
2. Em um novo frasco de vidro, preparar uma "solução de macrómero" pela combinação de 0,15 g de PCL-DA por ml de DCM. (Nota:. Para um andaime, ~ 1 ml de solução deve ser preparado) Tampão e misturar a solução a alta velocidade num misturador vortex durante ~ 1 min.
3. Em um novo frasco de vidro de 3 ml, preparar uma "solução de foto-iniciador" com base em 10% em peso de 2,2-dimetoxi-2-fenil-acetofenona (DMP) em 1-vinil-2-pirrolidinona (NVP). Combinar 0,115 g de DMP em 1 ml de NVP. (Nota: Para um andaime, ~ 180 ul é necessária.) Cap, embrulhe em papel alumínio (para bloquear a luz) e misturar a solução em alta velocidade em um misturador de vórticepara ~ 1 min. (Nota: Se preparada com antecedência, a solução deve ser refrigerada e protegida da luz).
4. Envolver o frasco contendo a solução de macrómero (excluindo a tampa) com folha de alumínio (para bloquear a luz) e adicionar através de uma pipeta de 15% em volume (baseada no volume total da solução de macrómero) da solução de foto-iniciador. Tampão e misturar a solução a alta velocidade num misturador vortex durante ~ 1 min.
5. Envolver o frasco que contém o molde sal fundido (excluindo a tampa) com folha de alumínio (para bloquear a luz) através de uma pipeta e adicionar a solução de macrómero / fotoiniciador previamente preparada (~ 0,6 ml ou até que o molde está completamente coberta).
6. Tapar o frasco, enrole em tecido e colocar na vertical num tubo de centrifugação. Centrifugar durante 10 minutos a 1.260 xg, para distribuir a solução de macrómero ao longo do molde.
7. Remover a película de alumínio, uncap o frasco e expor à luz UV (365 nm, 25 W) durante 3 min. O ar seco / N.
8. Retire o "scaffol contendo sald "do frasco para injectáveis ​​com uma pinça depois de marcar e fraturando a parte superior do frasco de vidro.
9. Em um copo de 400 ml, prepara ~ 200 ml de uma água / solvente de etanol (1: 1 vol: vol).
10. Manter o andaime submerso na água / solvente de etanol durante 4 dias, com mudanças de solvente diárias.
11. Remover o andaime do solvente e seca ao ar, O / N.

3. Aplicando polydopamine Coating para SMP Andaime (Figura 1)

1. Em 400 ml equipado com uma barra de agitação coberta de teflon, prepara ~ 200 ml de uma solução de cloridrato de dopamina (2 mg / ml em tampão Tris 10 mM, pH = 8,5, 25 ºC). Agita-se a ~ 150 rpm.
2. Coloque uma agulha descartável (comprimento = 40 mm; calibre = 20) para o cadafalso, ~ metade da distância através do andaime. Enrole um fio ao redor do centro da agulha.
3. Submerge o andaime (com o cubo de agulha acima da superfície da solução) na solução de dopamina agitação por ancoragem do fio até a borda do copo.
4. Desgasificar o andaime, colocando uma seringa para dentro do cubo de agulha e utilizando-a para puxar o ar para fora do andaime. (Nota: A desgaseificação é completa quando não mais ar pode ser removido e a solução foi completamente infiltrado o andaime.)
5. Manter o andaime submerso na solução de dopamina de se agitar durante 16 h.
6. Remover o andaime a partir da solução e remover a agulha. Lavar com água desionizada e seco numa estufa de vácuo à temperatura ambiente durante 24 h.
7. Colocar o andaime num forno de 85 ° C durante 1 h.
8. Permitir que o andaime arrefecer até à TA. O andaime cilíndrico final será ~ 6 mm de diâmetro x ~ 5 mm de altura.

4. Avaliando o comportamento "auto-montagem"

1. Preparar um "modelo de defeito CMF irregular" utilizando uma folha de plástico rígido cuja espessura é de aproximadamente 5 mm. Utilize uma broca para criar um vácuo dentro da folha de plástico com um diâmetro médio ligeiramente inferior a ~ 6 mm, como demonstrado na Figura 2A.
2. Em abEaker, água Dl calor (representando o uso clínico de solução salina) a uma temperatura de ~ 60 ° C.
3. Coloque o andaime para o copo de água ~ 60 ºC. Utilize uma pinça para empurrar o andaime abaixo da superfície da água, expondo todos os domínios para a água. Continuar para ~ 2 min ou até que o andaime é visivelmente amoleceu (Figura 2B).
4. Remova o cadafalso na taça e pressione imediatamente (com a mão) no defeito modelo.
5. Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente (~ 5-10 min) (Figura 2C).
6. Retire do defeito para observar o novo, forma fixa temporária e o retorno do estado relativamente mais rígida (Figura 2D).

5. Teste de Comportamento Memória de Forma

1. Utilizando um analisador mecânico dinâmico (DMA; por exemplo, um TA Instruments Q800, tal como aqui utilizado), executar um ensaio de compressão com deformação controlada cíclico térmico-mecânica sobre uma estrutura de suporte ao longo de dois ciclos de (N) para determinar a forma fixidez (R _f) emoldar recuperação _(R r) (Figura 3).
   1. Equilibrar a 60 ° C (T _alto) durante 5 min.
   2. Comprimir a uma tensão máxima (ε _m = 50%) a 50% / min.
   3. Manter a ε _m (5 min).
   4. Arrefecer até 25 ° C (T _baixo) e manter durante 10 min para fixar a forma temporária.
   5. Remover a carga.
   6. Meça a tensão final no estado livre de estresse (ε _u).
   7. Aquecer de novo para 60 ° C (T _alta) e manter durante 10 min para recuperar a forma permanente.
   8. Meça a tensão recuperado (ε _p).
   9. Enquanto ainda a 60 ° C (T _alta), iniciar o ciclo de ^ND 2 (N = 2), comprimindo o andaime a 50% da altura recuperado após o ciclo de ^r 1 (n = 1).
   10. Repita 5.1.3-5.1.8 Para N = 2.
   11. Calcular R _{f R} e R para N = 1 e 2, utilizando as seguintes equações:
       R _{f (n)} = [ε _L (N) / ε _m] r _{r (n)} = _[m ε - ε _P (N)] / _[m ε - ε _p (N-1)]

6. A visualização Pore Tamanho e Pore Interconectividade

1. Microscopia eletrônica de varredura (SEM; por exemplo, uma FEI Quanta SEM como aqui utilizado), observar o tamanho dos poros e poros interconectividade.
   1. Com uma pinça para segurar o andaime SMP, submergir em _N2 líquido durante 1 min.
   2. Remover do _N2 líquido e fractura ao longo do meio do andaime com uma lâmina de barbear limpo.
   3. Usando fita de carbono, apor uma das metades do SMP andaime sobre a amostrapalco com a superfície fraturada voltado para cima.
   4. Por pulverização catódica, revestimento com Au-Pt (~ 4 nm).
   5. Capturar a imagem SEM a uma voltagem de aceleração de 10-15 kV recomendado (Figura 4A).

7. Testes in vitro de bioatividade

1. Num tubo de centrífuga de 50 ml, adicionar 30 ml de ~ 1X SBF ^24.
2. Obter um andaime em sua forma original é permanente, cilindricamente-moldado. Corte o andaime ao meio (em toda a borda circular) usando uma lâmina limpo.
3. Coloque um andaime metade indivíduo no tubo de centrífuga preparada e cap.
4. Manter o tubo a 37 ° C num banho de água em condições estáticas sem alterações SBF.
5. Após 14 dias, remover o andaime de SBF e secar ao ar durante 24 horas.
6. Usando a fita de carbono, apor o andaime para o palco amostra com a superfície fraturada voltado para cima.
7. Por pulverização catódica, revestimento com Au-Pt (~ 4 nm).
8. Capturar a imagem SEM em um rerecomendou tensão de aceleração de 10-15 kV (Figura 4B).

Resultados

O resultante PMS andaime baseado no PCL é capaz de auto-montagem em um modelo de defeito de CMF (Figura 2). Depois de uma breve exposição a aquecer salina (~ 60 ° C), o andaime cilíndrica amolece permitindo que a escora seja pressionada manualmente para dentro e para expandir dentro do defeito modelo. Após arrefecimento até à TA, o andaime é fixada na sua nova forma temporária, que é mantida após a remoção do defeito.

O comportamento de memória de forma de um ...

Discussão

Este protocolo descreve a preparação de, uma estrutura de suporte com base em PCL revestidos por polydopamine cujo comportamento de auto-montagem, bem como osteoindutividade e bioactividade, faz com que seja de interesse para o tratamento de defeitos ósseos irregulares CMF. Aspectos do protocolo pode ser alterado para alterar várias características de andaime.

O protocolo começa com um acrylation de PCL-diol para permitir a cura por UV. No exemplo relatados, o PCL-diol H _{n é}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Triethylamine (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Acryloyl chloride	Sigma-Aldrich	A24109
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
Potassium carbonate (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher	M65
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Dopamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	H8502
Tris buffer (2mol/L)	Fisher	BP1759	Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve	VWR	47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA)	TA Instruments	Q800
High Resolution Sputter Coater	Cressington	208HR
Scanning Electron Microscope (SEM)	FEI	Quanta 600