생리 활성, PCL 기반 "셀프 피팅"형상 기억 폴리머 비계의 제작

요약

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

초록

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

서문

현재 부교감 악안면 (CMF) 골 결손 치료의 황금 표준으로 간주, 수확자가 이식의 이식은 복잡한 이식 절차, 공여부의 이환율과 제한된 가용성 ^(1)에 의해 방해된다. 특별한 어려움은 성형 및 골 유착을 얻고 그래프트 재 흡수를 방지하기 위해, 결함에 단단히 강성 자가골 고정된다. 조직 공학은 autografting하는 대안 전략 및 합성 골 대체물 (예를 들면 뼈 시멘트) ^2,3로 조사되었다. 조직 공학 방법의 성공에 중요한 속성의 특정 세트 발판이다. 우선 골융합을 달성하기 위해, 지지체는 인접한 뼈 조직 ^(4)에 밀착 형성한다. 발판은 세포 이동, 영양 확산과 neotissue 증착 ^{4,5 허용,} osteoconductive해야한다. 이 동작은 일반적으로 생분해 SCA 달성된다ffolds는 고도로 상호 연결된 기공 형태를 나타내는. 뼈 조직 ^{(5) 주변과의} 통합 및 결합을 촉진하기 위해 마지막으로, 지지체는 생체 활성해야합니다.

여기, 우리는 이러한 특성을 가진 조직 공학 발판을 준비하는 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 지지체는 형상 기억 행동 ⁶ 불규칙한 CMF 결함에 "자기 끼움"할 수있는 능력을 나타낸다. Thermoresponsive 형상 기억 폴리머 장치 (SMPS)는 ^7,8 열에 노출시에 형상 변화를 겪는 것으로 알려져있다. SMP의 영구 형상 및 임시 형태를 유지하고, 영구 형상 복구 "스위칭 세그먼트"결정 "netpoints"(즉, 화학적 또는 물리적 가교)로 구성된다. 스위칭 세그먼트 중 유리 전이 (T의 _g)에 대응하는 열 전이 온도 (T _{트란스)를} 나타낼 또는 중합체의 천이 (T의 _m)을 용융. 으로결과는 SMP의 순차적 T 트랜스에서 임시 형태로 고정 T> T _{트랜스에서} 임시 모양으로 변형하고, T> T _트랜스의 영구적 인 형태로 회수 할 수있다. ^(6)을 다음과 같이 따라서, SMP의 발판은 CMF 결함에서 "셀프 피팅"달성 할 수있다. 노출 후 식염수 (T> T _트랜스), SMP의 발판이 모양 복구 결함 경계에 발판의 확장을 촉진하여, 손으로 누르면 불규칙한 결함에로 일반적으로 제조 된 원통형의 발판을 허용, 가단 될 것 따뜻하게. (T 트랜스)를 냉각시, 비계 모양의 정착이 결함 내 새 임시 형태를 유지하면서, 상대적으로 더 단단한 상태로 반환합니다. 이 프로토콜에서, SMP의 발판은 생분해 성 고분자는 조직 재생 및 기타 생물 의학 응용 프로그램에 ^9-11에 대한 광범위하게 연구, 폴리 카프로 락톤 (PCL)에서 제조된다. 형상 기억하십시오, 일PCL의 전자의 _{m T는} T _트랜스 역할 및 PCL ^(12)의 분자량에 따라, 43과 60 사이에서 변화 ºC. 이 프로토콜에서, 지지체의 T _트랜스 (즉 T의 _m)은 56.6 ± 0.3 ºC ^6입니다.

osteoconductivity을 달성하기 위해, 프로토콜은 용매 캐스팅 미립자 침출 (SCPL) ^6,13,14 방법에 기초하여 고도로 상호 연결된 기공 PCL 기반 SMP 골격을 위해 개발되었다. 디 아크릴 레이트, 폴리 카프로 락톤 (PCL-DA) (M = _N ~ 10,000g / mol)을 신속하게, 광 화학적 가교 결합을 허용하기 위해 이용하고, 염 템플리트 위에 용매 캐스팅을 허용하는 디클로로 메탄 (DCM)에 용해시켰다. 광화학 요법 및 용매 증발에 이어, 염 템플릿을 물에 침출하여 제거 하였다. 염 평균 크기는 골격의 기공 크기를 조절한다. 중요한 것은, 염 템플릿 전에 기공 interconnectivi을 달성 캐스팅 용매 물과 융합시켰다타이.

생체 활성은 기공 벽 ^(6)에 polydopamine 코팅의 현장 형성에 의한 SMP 지지체에 부여했다. 생체 활성은 종종 유리 또는 유리 - 세라믹 충전제 ^(15)의 포함으로 골격에 도입된다. 그러나, 이들 원치 않는 취성 기계적 특성을 야기 할 수있다. 도파민은 기판의 다양한 ^16-19에 부착, polydopamine 얇은 층을 형성하는 것으로 나타났다. 이 프로토콜에서, SMP 지지체 모든 기공 벽 표면에 ⁶ polydopamine nanothick의 피막을 형성하는 도파민 약간 염기성 용액 (PH = 8.5)를 실시 하였다. 개선 된 세포 접착을위한 표면의 친수성을 향상시키고 확산 외에 polydopamine는 모의 체액 (SBF) ^18,20,21 노출시 하이드 록시 아파타이트의 형성 (HAP)의 관점에서 생물 것으로 밝혀졌다. 마지막 단계에서, 코팅 된 지지체를 85 ºC (T> T _트랜스) WH 열처리를 노출무형 문화 유산은 치밀화를 폴딩 할 이어집니다. 열처리는 이전 PCL 결정질 도메인 가까이 근접 ¹⁴ 재구성 아마도 인해, 골격 형상 기억 행동 필수적인 것으로 관찰되었다.

우리는 또한, 불규칙한 모델 결함 내에서 자체 맞는 행동을 특징 짓는 용어로 변형 제어 순환 열 기계 압축 테스트 메모리 동작을 형성 (즉, 형상 회복과 정착을 형성)하는 방법을 설명하는 형태 기공, 체외 생체 활성에. 발판의 특성을 조정하는 전략도 제공됩니다.

프로토콜

1. 합성 PCL-DA 로머

1. 아크릴화 반응을 실행합니다.
   1. 테프론 피복 자기 교반 바가 장착 된 250 mL의 둥근 바닥 플라스크에 PCL 디올 (M에서 _N = ~ 10,000g / 몰) 20g을 단다.
   2. DCM에서 PCL 디올을 녹인다.
      1. 플라스크에 120 mLlof DCM 추가 (농도 = 0.17 ㎍ / ㎖).
      2. 또한 DCM의 증발을 방지하면서 압력 빌드 업을 피하기 위해, 플라스크의 목에 느슨하게 고무 격막을 배치.
      3. ~ 250 rpm에서 30 분 ~ 동안 교반 솔루션은 완전히 폴리머를 용해한다.
   3. 용액에 4- 디메틸 아미노 피리딘 (DMAP)의 ~ 6.6 ㎎을 추가하고, 교반하면서 용해.
   4. 플라스크의 목에 단단히 고무 격막을 놓습니다. 이 솔루션은 교반을 계속하도록 허용합니다.
   5. 고무 격막을 통해 조심스럽게 긍정적 인 N ₂ 압력 바늘 입구와 오픈 바늘을 사용하여 2 ~ 3 분 동안 N ₂ 플라스크를 제거출구로.
   6. N ₂ 입구와 출구를 분리합니다.
   7. 고무 셉텀을 통해 삽입 된 바늘이 장착 된 유리 주사기를 통해 트라이 에틸 아민 0.56 ㎖ (4.0 밀리몰) (N 잇 ₃₎ 적가.
   8. 고무 셉텀을 통해 삽입 된 바늘이 장착 된 유리 주사기를 통해 적가 아크릴로 일 클로라이드 0.65 ㎖ (8.0 밀리몰)을 추가한다.
   9. 플라스크에 N ₂ 입구를 돌아 내용이 ~에 대해 긍정적 인 N ₂ 압력을 받고 30 분을 자극 할 수 있습니다.
   10. 55 ºC로 오일 욕을 예열.
   11. 할당 ~ 30 분 후, N ₂ 입구를 제거하고 응축기 격벽을 대체.
   12. 예열 오일 배스에​​ 플라스크를 담근다.
   13. 플라스크의 내용물을 20 시간 동안 교반한다.
   14. 할당 된 20 시간 후, 오일 조로부터 플라스크를 제거하고 내용물을 실온으로 냉각 할 수있다.
   15. 회전 증발기를 사용하여, 플라스크에 DCM에서 용매를 제거한다.
2. 피원유 PCL-DA 제품을 urify.
   1. 플라스크에, 아세트산 에틸 ~ 135 mL를 추가하고, 조 PCL-DA를 녹인다.
   2. 중력은 깨끗한 250 mL의 둥근 바닥 플라스크에 여과지 용액을 필터. (참고 : 솔루션을 쉽게 통과하지, 필터 종이에 두껍게 할 수 있으므로,주의 깊게 가열 총으로 가벼운 열을 적용하면..)
   3. 회전 증발기를 사용하여, 용매를 플라스크로부터 에틸 아세테이트를 제거한다.
   4. 플라스크에, DCM ~ 140 mL로 추가 조질 PCL-DA를 녹인다.
   5. 500 mL의 분액 깔때기에 내용을 전송합니다.
   6. 깔때기에, 2 M 탄산 칼륨 (K ₂ CO _3)의 13.5를 가하여.
   7. 깔때기를 모자. 조심스럽게 마개를 통해 압력을 해제 돌보는, 깔때기를 반전 부드럽게 한 번 또는 두 번 소용돌이에 의해 두 개의 층을 섞는다. 3 번 반복합니다.
   8. 파라 필름의 층으로 뚜껑을 교체하고, 혼합물 O / N (~ 12 시간)을 분리 할 수​​ 있습니다.
   9. 저부를 수집하거나250 mL의 삼각 플라스크에 ganic 층.
   10. 플라스크에 무수 황산 마그네슘 5g ~ _(황산)를 첨가하고, 가볍게 소용돌이.
   11. 중력은 둥근 바닥 플라스크 정성 여과지 및 깨끗한 250 ㎖ 중에 혼합물을 필터.
   12. 회전 증발기를 사용하여, 플라스크에 DCM에서 용매를 제거한다.
   13. 높은 진공 하에서 건조 잔류 DCM을 제거합니다. (참고 : PCL-DA는 빛으로부터 멀리 보관해야합니다.)
   14. ¹ H NMR ^{(22, 23)와} 아크릴화를 확인합니다.

SMP 비계를 준비​​ (2) (그림 1)

1. 용융 소금 템플릿을 준비합니다.
   1. 직경이 70 ~ 460 μm의 ± 염화나트륨 입자를 얻기 위해 425 ㎛의 체를 사용한다. (주 : 평균 입경은 ImageJ에 소프트웨어를 주사 전자 현미경 [SEM] 이미지에서 확인 될 수있다.) ¹⁴
   2. 3 ㎖의 유리 바이알 (ID = 12.9 mm)에, 이전에 체질 염화나트륨 1.8 g을 추가한다.
   3. 천천히 유리 병에 네 부분, 7.5 중량 % (소금의 중량을 기준으로) 탈 이온수 (0.146 g)에 추가 할 수 있습니다. 물의 각 부의 첨가 후 금속 주걱으로 혼합한다.
   4. , 유리 병 캡 조직 포장 및 원심 분리 관에 수직으로 배치합니다. 3,220 X g에서 15 분 동안 원심 분리기.
   5. 뚜껑을 제거하고 자연 건조 O / N (~ 12 시간)을 할 수 있습니다.
2. 새로운 유리 바이알에서, DCM 1 ㎖ 당 PCL-DA 0.15 g을 조합함으로써 "로머 ​​용액"을 준비한다. (주 :. 한 지지체를 들어, ~ 용액 1 ㎖를 제조한다)과 캡은 ~ 1 분 동안 와동 믹서 고속으로 용액을 혼합한다.
3. 새로운 3 mL 유리 바이알에, 10 중량 %, 2,2- 디메 톡시 -2- 페닐 아세토 페논 1- 비닐 -2- 피 롤리 디논 (DMP) (NVP)에 기초하여 "광개시제 용액"을 준비한다. NVP의 1 ml의 DMP의 0.115 g을 결합합니다. (빛을 차단하기 위해) 알루미늄 호일에 포장, 모자 및 와류 믹서에 빠른 속도로 솔루션을 혼합 : (180 μL가 필요합니다 ~, 하나의 발판은. 참고)~ 1 분. (참고 : 고급에서 제조하는 경우, 용액을 냉각하고 빛으로부터 보호되어야한다.)
4. 알루미늄 호일 (캡 제외) 거대 단량체 용액을 함유하는 바이알을 랩 (빛을 차단하는) 피펫을 통해 15 부피 %를 추가 개시제 용액 (거대 단량체 용액의 총 부피를 기준으로). 캡 ~ 1 분 동안 와동 믹서 고속으로 용액을 혼합한다.
5. 알루미늄 호일 (캡 제외) 용융 염 템플릿을 함유 바이알을 랩 (빛을 차단하기 위해) 및 피펫을 통해 미리 제조 로머 / 광개시제 용액을 추가 (~ 0.6 ㎖에 또는 템플릿까지 완전히 피복).
6. , 유리 병 캡 조직 포장 및 원심 분리 관에 수직으로 배치합니다. 템플릿 전반 로머 용액을 분배 1,260 XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
7. 알루미늄 호일을 제거 병을 뚜껑을 벗기다, 3 분 동안 자외선 (365 nm의 25 승)에 노출. 공기 건조 O / N.
8. "소금 함유 scaffol 제거득점과 유리 병의 상단을 골절 후 핀셋으로 유리 병에서 D ".
9. (1 부피 : 부피 1) 400 ㎖의 비이커에, ~ 용매를 물 / 에탄올 200 ㎖를 준비한다.
10. 매일 용매 변경 4 일 동안 용매 물 / 에탄올에 빠져들 골격을 유지한다.
11. 용매 및 자연 건조 O / N에서 비계를 제거합니다.

3. SMP 비계에 Polydopamine 코팅을 적용 (그림 1)

1. 테프론 피복 교반 바가 장착 된 400 ml의 비이커에, 도파민 염산염 용액 ~ 200 ㎖ (10 mM 트리스 완충액에 2 ㎎ / ㎖, pH는 8.5, 25 ºC)를 준비한다. ~ 150 rpm으로 저어.
2. 거리의 절반 발판을 발판으로, ~, 일회용 바늘 (게이지 = 20 길이 = 40 mm)를 놓습니다. 바늘 허브 주위에 와이어를 감 쌉니다.
3. 비이커의 림에 와이어를 고정함으로써 도파민 교반 용액에 (솔루션면 위에 바늘 허브)와 발판을 담근다.
4. 바늘 허브에 주사기를두고 지지체의 공기를 끌어을 사용하여 발판을 탈기. (주 : 더 많은 공기가 제거 될 수 없으며 용액이 완전히 지지체에 침투되면 탈기 완료).
5. 16 시간 동안 교반 도파민 솔루션에 빠져들 골격을 유지한다.
6. 솔루션에서 비계를 제거하고 바늘을 제거합니다. 24 시간 동안 실온에서 진공 오븐에서 탈 이온수로 세정하고 건조.
7. 1 시간 동안 85 ºC 오븐에서 비계를 놓습니다.
8. 발판은 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 마지막 원통형 비계 ~ 6mm 직경 X ~ 5mm 높이됩니다.

4. 평가 "셀프 피팅"행동

1. 두께 ~ 5mm 인 경질 플라스틱 시트를 이용한 "CMF 요철 결함 모델"을 준비한다. 그림 2A에서 입증 된 바와 같이, ~ 6mm보다 약간 적은 평균 직경 플라스틱 시트 내의 빈 공간을 만들기 위해 드릴을 사용합니다.
2. AB에서eaker ~ 60 ºC의 온도 (식염수 임상 사용을 나타내는) 열 DI 물.
3. 의 비커 ~ 60 ºC 물에 비계를 놓습니다. 물에 모든 영역을 노출, 수면 아래의 발판을 밀어 핀셋을 사용합니다. 1 ~ 2 분 동안 또는 발판이 눈에 띄게 (그림 2B)을 부드럽게 될 때까지 계속합니다.
4. 비커에서 비계를 제거하고 즉시 모델의 결함으로 (손으로) 키를 누릅니다.
5. RT (~ 5 ~ 10 분) (그림 2C)을 식 힙니다.
6. 새로운 고정 임시 모양과 상대적으로 단단한 상태 (그림 2D)의 반환을 관찰하기 위해 결함에서 제거합니다.

5. 시험 형상 기억 동작

1. 동적 기계 분석기를 사용하여 (DMA 본원에서 사용 된 바와 같이, 예를 들면 TA 인스트루먼트 Q800)를, 2 사이클 (N) 형상으로 고정 인 (R의 _F)를 결정하기 위해 이상 지지체에 변형 제어형 환상 열적 기계적 압축 시험을 실행할복구 (R의 _R) (그림 3) 모양입니다.
   1. 5 분 60 ° C (T _높은) 평형.
   2. 50 % / 분에서 최대 변형 (ε _분 = 50 %)에 압축.
   3. ε _분 (5 분)에서 잡으십시오.
   4. 25 ° C (T _{낮음)으로} 냉각시키고, 10 분 임시 모양을 수정하는 유지한다.
   5. 부하를 제거합니다.
   6. _(U ε) 스트레스없는 상태에서 궁극의 변형을 측정합니다.
   7. 60 ° C (T _높음)로 재가열하고 10 분 영구 형상을 회복하기 위해 유지한다.
   8. 복구 된 변형 (ε의 _p)를 측정한다.
   9. 아직 (T _높음) 60 ℃에서, 2 ^{차 사이클을} 시작 (N = 2) ¹ 차 ^사이클 후에 회수 높이 (N = 1)의 50 %로 압축하여 발판을한다.
   10. 5.1 반복.3-5.1.8 N = 2.
   11. 다음 식을 이용하여 N = 1, R 2의 _F 및 R의 _R을 계산한다 :
       R의 _F (N) = _[U ε (N) / ε _분] R의 _R (N) = ε _분 - ε의 _P (N)] / [ε _M - ε의 _P (N-1)]

6. 떠올리 기공 크기와 기공 상호 접속

1. 주사 전자 현미경을 사용하여 (SEM, 예를 들면 본원에서 사용 FEI 콴타 SEM)을, 공극 크기를 관찰하고 상호 기공.
   1. 핀셋을 사용하면, SMP의 발판을 개최 1 분 동안 액체 N _2에 잠수함합니다.
   2. 깨끗한 면도날과 발판의 중앙을 따라 액체 N _2, 골절에서 제거합니다.
   3. 카본 테이프를 사용하여, 시료에 SMP 골격 반쪽들 중 하나를 부착골절면이 위를 향하게하여 무대.
   4. 금-PT (~ 4 ㎚)와 코트를 스퍼터.
   5. 10 ~ 15 kV의 (그림 4A)의 권장 가속 전압의 SEM 이미지를 캡처합니다.

체외에서 생체 활성 7. 테스트

1. 50 ㎖ 원심 분리 튜브로, ²⁴ ~ 1X SBF 30ml의 추가.
2. 원래, 원통형 성형 영구 모양의 발판을 얻습니다. 깨끗한 블레이드를 사용하여 (원형 모서리에서) 반 비계를 잘라.
3. 준비된 원심 분리기 튜브와 캡으로 개별 발판 절반을 놓습니다.
4. SBF 변경없이 정적 조건 하에서 수조에서 37 ℃에서 튜브를 유지한다.
5. 십사일 후, 24 시간 동안 SBF 공기 건조에서 비계를 제거합니다.
6. 탄소 테이프를 사용하여, 골절면이 위를 향하도록하여 샘플 무대에 발판을 부착합니다.
7. 금-PT (~ 4 ㎚)와 코트를 스퍼터.
8. 재에서 SEM 이미지를 캡처10 ~ 15 kV의 (그림 4B)의 가속 전압을 칭찬.

결과

그 결과 PCL 기반 SMP 골격 자체 피팅 모델 CMF 결함으로 (그림 2) 할 수있다. 짧은 노광 후 염수 (~ 60 ° C)을 가온, 원통형 지지체는 지지체가 수동으로 가압 모델 결함 내에 확장 될 수 있도록 연화. RT로 냉각시킨 후, 지지체는 결함으로부터 제거시에 유지되어 새로운 임시 형상으로 고정된다.

SMP 지지체의 형상 기억 거동 형상 고정 인 (R의 _F)와 형상 복구 (R의...

토론

이 프로토콜은, 자기 피팅 동작 polydopamine 코팅, PCL 계 지지체의 제조뿐만 아니라, 생체 활성 및 osteoinductivity 설명 불규칙한 CMF 뼈 결함의 치료에서 관심을 만든다. 프로토콜의 측면은 다양한 비계 기능을 변경하는 변경 될 수있다.

이 프로토콜은 UV 경화를 허용하는 PCL 디올의 아크릴화로 시작합니다. 보고 된 예에서, PCL 디올 M _n을 ~ 10,000g / 몰이다. 그러나, 적절 PCL-DA, ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Triethylamine (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Acryloyl chloride	Sigma-Aldrich	A24109
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
Potassium carbonate (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher	M65
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Dopamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	H8502
Tris buffer (2mol/L)	Fisher	BP1759	Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve	VWR	47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA)	TA Instruments	Q800
High Resolution Sputter Coater	Cressington	208HR
Scanning Electron Microscope (SEM)	FEI	Quanta 600