Realizzazione di una sede a PCL Bioactive, "Self-fitting" Shape Memory Polymer Ponteggio

Riepilogo

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Abstract

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Introduzione

Attualmente considerato il gold standard di cranio-maxillo-facciale (CMF) Trattamenti difetto osseo, trapianto di innesti autologhi raccolti è ostacolato da procedure di innesto complesse, sito donatore la morbilità e la disponibilità limitata ^1. Una particolare difficoltà sta plasmando e fissa l'autotrapianto rigida saldamente nel difetto al fine di ottenere osteointegrazione e per prevenire il riassorbimento dell'innesto. L'ingegneria dei tessuti è stata studiata come una strategia alternativa per autotrapianto e sostituti ossei sintetici (ad esempio cemento osseo) ^2,3. Fondamentale per il successo di un approccio di ingegneria tissutale è un ponteggio con un set specifico di proprietà. In primo luogo, al fine di raggiungere l'osteointegrazione, il ponteggio deve formare stretto contatto con il tessuto osseo adiacente ^4. Il ponteggio deve essere anche osteoconduttivo, permettendo la migrazione delle cellule, la diffusione dei nutrienti e neotissue deposizione ^4,5. Questo comportamento viene generalmente raggiunta con sca biodegradabileffolds esibendo un poro morfologia fortemente interconnesso. Infine, il ponteggio deve essere bioattivo in modo da promuovere l'integrazione ed il legame con circostante tessuto osseo ^5.

Qui, vi presentiamo un protocollo per preparare una impalcatura ingegneria dei tessuti con queste proprietà. È importante sottolineare che questa impalcatura mostra la capacità di "auto-fit" in difetti irregolari CMF grazie al suo comportamento memoria di forma ^6. Polimeri a memoria di forma Thermoresponsive (SMPS) sono noti per subire un cambiamento di forma in seguito all'esposizione al calore ^7,8. SMP è formata da "NETPoint" (cioè legami crociati chimici o fisici), che determinano la forma permanente e "segmenti di commutazione", che mantengono la forma temporanea e recuperano la forma permanente. I segmenti di commutazione presentano una temperatura di transizione termica (T _trans) corrispondente sia alla transizione vetrosa _(Tg) o fondere transizione (T _m) del polimero. ComeDi conseguenza, SMP può essere deformata in sequenza in una forma temporanea a T> T _trans, fisso a forma temporaneo T trans, e recuperato alla forma permanente a T> T _trans. Così, un ponteggio SMP potrebbe realizzare "self-fitting" all'interno di un difetto CMF come segue ^6. Dopo l'esposizione a scaldare salina (T> T _trans), un ponteggio SMP sarebbe diventato malleabile, permettendo un ponteggio cilindrica genericamente preparato per essere in un difetto irregolare pressato a mano, con recupero della forma promuovere l'espansione del ponteggio al confine difetto. Al raffreddamento (T trans), l'impalcatura sarebbe tornato al suo stato relativamente più rigida, con forma fissità mantenere la sua nuova forma temporanea all'interno del difetto. In questo protocollo, una impalcatura SMP è preparato da policaprolattone (PCL), un polimero biodegradabile studiato ampiamente per la rigenerazione dei tessuti e altre applicazioni biomediche ^9-11. Per la memoria di forma, the T _m di PCL funge T _trans e varia tra 43 e 60 ° C, a seconda del peso molecolare del PCL ^12. In questo protocollo, il T _trans (vale a dire T _m) del patibolo è 56,6 ± 0,3 ° C ^6.

Per raggiungere osteoconduttività, un protocollo è stato sviluppato per rendere scaffold SMP basati PCL con pori altamente interconnessi basati su un metodo ^{6,13,14-colata} solvente particolato lisciviazione (SCPL). Polycaprolactone diacrilato (PCL-DA) (M _n = ~ 10.000 g / mol) è stata utilizzata per permettere una rapida, reticolazione fotochimica ed è stato sciolto in diclorometano (DCM) per consentire solventi colata sul modello sale. Dopo polimerizzazione fotochimica ed evaporazione del solvente, il modello di sale è stato rimosso per lisciviazione in acqua. La dimensione media del sale regola dimensione dei pori patibolo. È importante sottolineare che il modello sale era fusa con acqua prima di solvente di fusione per ottenere pori interconnectivity.

Bioattività è stata impartita al ponteggio SMP dalla formazione in situ di un rivestimento polydopamine sulle pareti dei pori ^6. Bioattività è spesso introdotto ponteggi dall'inclusione di vetro o vetroceramica riempitivi ^15. Tuttavia, questi possono dare origine a indesiderati fragili proprietà meccaniche. La dopamina ha dimostrato di formare un aderente, polydopamine strato sottile su una varietà di substrati ^16-19. In questo protocollo, l'impalcatura SMP è stato sottoposto ad una soluzione leggermente basica (pH = 8,5) di dopamina per formare un rivestimento di nanothick polydopamine su tutte le superfici murali pori ^6. Oltre a migliorare idrofilicità superficiale per migliorare l'adesione cellulare e la diffusione, polydopamine ha dimostrato di essere bioattivo in termini di formazione di idrossiapatite (HAP) in seguito all'esposizione al liquido corporeo simulato (SBF) ^18,20,21. In un ultimo passaggio, l'impalcatura rivestito viene esposto a trattamento termico a 85 ° C (T> T _trans) which porta a ponteggi densificazione. Il trattamento termico è stato precedentemente notato per essere essenziale per il comportamento a memoria di forma patibolo, forse a causa di domini cristallini PCL riorganizzazione di maggiore vicinanza ^14.

Abbiamo inoltre descritti i metodi per caratterizzare il comportamento auto-montaggio all'interno di un modello di difetto irregolare, plasmare il comportamento in termini di memoria prove di compressione meccanica ciclico-termici deformazione controllata (cioè recupero della forma e modellare la fissità), poro morfologia, e in bioattività vitro. Strategie per adattare le proprietà impalcature sono anche presentati.

Protocollo

1. Synthesizing PCL-DA macromero

1. Eseguire la reazione acrylation.
   1. Pesare 20 g di PCL-diol (M _{n =} ~ 10.000 g / mol) in un 250 ml pallone da fondo dotati di ancoretta magnetica Teflon coperto.
   2. Sciogliere il PCL-diolo in DCM.
      1. Aggiungere 120 mLlof DCM al pallone (concentrazione = 0,17 g / ml).
      2. Collocare un setto di gomma liberamente nel collo del pallone in modo da evitare l'accumulo di pressione evitando anche l'evaporazione di DCM.
      3. Mescolare la soluzione per ~ 30 min a ~ 250 rpm per sciogliere completamente il polimero.
   3. Aggiungere ~ 6,6 mg di 4-dimetilamminopiridina (DMAP) alla soluzione e sciogliere sotto agitazione.
   4. Collocare un setto di gomma saldamente nel collo del pallone. Lasciare che la soluzione per continuare a mescolare.
   5. Il setto di gomma, eliminare delicatamente il pallone con N ₂ per ~ 3 min utilizzando un positivo N ₂ ago pressione in ingresso e un ago apertocome valvola di sfogo.
   6. Rimuovere l'ingresso N ₂ e uscita.
   7. Aggiungere 0,56 ml (4,0 mmoli) di trietilammina (Et ₃ N) goccia a goccia con una siringa di vetro dotato di un ago inserito attraverso il setto di gomma.
   8. Aggiungere 0,65 ml (8,0 mmoli) di cloruro di acriloile gocciolata mediante una siringa di vetro dotato di un ago inserito attraverso il setto di gomma.
   9. Restituisce l'ingresso N ₂ al pallone e permettere ai contenuti di mescolare sotto pressione positiva di N ₂ per ~ 30 min.
   10. Preriscaldare bagno d'olio a 55 ° C.
   11. Dopo l'assegnato ~ 30 min, rimuovere l'ingresso N ₂ e sostituire il setto con un condensatore.
   12. Immergere il pallone nel bagno d'olio preriscaldato.
   13. Lasciare il contenuto del pallone per mescolare per 20 ore.
   14. Dopo il assegnato 20 ore, togliere il pallone dal bagno d'olio e lasciare raffreddare il contenuto alla RT.
   15. Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere DCM solvente dal pallone.
2. Purify il greggio prodotto PCL-DA.
   1. Per il matraccio, aggiungere ~ 135 ml di acetato di etile e sciogliere il greggio PCL-DA.
   2. Filtro a gravità la soluzione attraverso carta da filtro in un pallone a fondo tondo pulite 250 ml. (Nota: La soluzione può addensare sulla carta da filtro, non facilmente passando caso affermativo, applicare accuratamente leggero calore con una pistola di riscaldamento..)
   3. Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere acetato di etile solvente dal pallone.
   4. Per il matraccio, aggiungere ~ 140 ml di DCM e sciogliere il greggio PCL-DA.
   5. Trasferire il contenuto di un 500 ml imbuto separatore.
   6. Per l'imbuto, aggiungere 13,5 ml di 2 M di carbonato di potassio (K ₂ CO _3).
   7. Tappare l'imbuto. Mescolare delicatamente i due strati invertendo l'imbuto e ruotare delicatamente una o due volte, avendo cura di scaricare la pressione tramite il rubinetto. Ripetere 3 volte.
   8. Sostituire il tappo con uno strato di Parafilm e lasciare che la miscela da separare O / N (~ 12 ore).
   9. Raccogliere il fondo, ostrato di Ganic in un pallone da 250 ml Erlenmeyer.
   10. Aggiungere ~ 5 g di solfato di magnesio anidro _(MgSO4) al pallone e miscelare delicatamente.
   11. Gravity filtrare il composto attraverso carta da filtro qualitativo e in un ambiente pulito da 250 ml pallone fondo.
   12. Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere DCM solvente dal pallone.
   13. Secco sotto alto vuoto per rimuovere residui di DCM. (Nota: PCL-DA deve essere conservato al riparo dalla luce.)
   14. Confermare acrylation ^con 1 H NMR ^22,23.

2. Preparare il SMP Scaffold (Figura 1)

1. Preparare il modello di sale fuso.
   1. Utilizzare un setaccio 425 micron per ottenere cloruro di sodio (NaCl) particelle ~ 460 ± 70 micron di diametro. (Nota: dimensione media delle particelle può essere confermata da microscopia elettronica a scansione [SEM] le immagini con il software ImageJ.) ¹⁴
   2. Per una fiala di vetro 3 ml (ID = 12.9 mm), aggiungere 1,8 g di NaCl precedentemente setacciata.
   3. Aggiungere lentamente, in quattro porzioni, 7,5% in peso (in base al peso del sale) acqua DI (0,146 g) al flaconcino. Mescolare con una spatola metallica dopo l'aggiunta di ogni porzione di acqua.
   4. Tappare la fiala, avvolgere nel tessuto e posizionare verticalmente in una provetta da centrifuga. Centrifugare per 15 minuti a 3220 x g.
   5. Rimuovere il tappo e lasciare asciugare O / N (~ 12 ore).
2. In una nuova fiala di vetro, preparare una "soluzione macromero" combinando 0,15 g di PCL-DA per ml di DCM. (Nota:. Per un patibolo, ~ 1 ml di soluzione devono essere preparati) Cap e mescolare la soluzione ad alta velocità su un vortex per ~ 1 min.
3. In una nuova fiala di vetro 3 ml, preparare una "soluzione di fotoiniziatore" basata su 10% in peso 2,2-dimetossi-2-fenil acetofenone (DMP) in 1-vinil-2-pirrolidinone (NVP). Combinare 0.115 g di DMP in 1 ml di NVP. (Nota: Per un ponteggio, ~ è richiesto di 180 ml.) Cap, avvolgerlo in un foglio di alluminio (per bloccare la luce) e mescolare la soluzione ad alta velocità su un vortexper ~ 1 min. (Nota: se preparata in anticipo, la soluzione deve essere conservata in frigorifero e al riparo dalla luce.)
4. Avvolgere la fiala contenente la soluzione macromero (escluso il tappo) con un foglio di alluminio (per bloccare la luce) e inserirlo tramite pipetta 15 vol% (in base al volume totale della soluzione macromero) della soluzione fotoiniziatore. Cap e mescolare la soluzione ad alta velocità su un vortex per ~ 1 min.
5. Avvolgere il flaconcino contenente il modello di sali fusi (escluso il tappo), con un foglio di alluminio (per bloccare la luce) e aggiungere tramite pipetta la soluzione macromero / fotoiniziatore precedentemente preparato (~ 0,6 ml o fino a quando il modello è completamente coperto).
6. Tappare la fiala, avvolgere nel tessuto e posizionare verticalmente in una provetta da centrifuga. Centrifugare per 10 minuti a 1.260 xg per distribuire la soluzione macromero tutto il modello.
7. Togliere il foglio di alluminio, stappando la fiala ed esporre alla luce UV (365 nm, 25 W) per 3 min. O asciugare / N.
8. Rimuovere la "scaffol sale contenentid "dalla fiala con una pinzetta dopo aver realizzato e fratturazione della parte superiore della fiala di vetro.
9. In un becher da 400 ml, ~ preparare 200 ml di acqua / etanolo solvente (1: 1 vol: vol).
10. Mantenere il ponteggio sommerso in acqua / etanolo solvente per 4 giorni con variazioni giornaliere solvente.
11. Rimuovere il patibolo dal solvente e asciugare O / N.

3. L'applicazione di Polydopamine Coating per SMP Scaffold (Figura 1)

1. In 400 ml becher munito di ancoretta Teflon coperto, preparare ~ 200 ml di una soluzione di dopamina cloridrato (2 mg / ml in tampone Tris 10 mM, pH = 8,5, 25 ° C). Mescolare a ~ 150 rpm.
2. Inserire un ago monouso (lunghezza = 40 mm; scartamento = 20) nel scaffold, ~ metà della distanza attraverso il ponteggio. Avvolgere un filo attorno al mozzo ago.
3. Immergere il ponteggio (con il mozzo dell'ago sopra la superficie della soluzione) nella soluzione dopamina agitazione ancorando il filo al bordo del becher.
4. Degassare il ponteggio inserendo una siringa nel mozzo dell'ago e usarlo per estrarre aria dal ponteggio. (Nota: degassamento è completa quando non più aria può essere rimosso e la soluzione è completamente infiltrato il ponteggio.)
5. Mantenere il ponteggio immerso nella soluzione dopamina agitazione per 16 ore.
6. Rimuovere il ponteggio dalla soluzione e rimuovere l'ago. Risciacquare con acqua deionizzata e asciugare in un forno sotto vuoto a temperatura ambiente per 24 ore.
7. Posizionare il patibolo in un forno 85 ° C per 1 ora.
8. Lasciare che il patibolo raffreddare a temperatura ambiente. L'impalcatura cilindrico finale sarà ~ 6 mm di diametro x ~ 5 mm di altezza.

4. La valutazione del comportamento "Self-fitting"

1. Preparare un "irregolare modello di difetto CMF" utilizzando un foglio di plastica rigida con spessore ~ ​​5 mm. Utilizzare un trapano per creare un vuoto all'interno del foglio di plastica con un diametro medio di poco inferiore ~ 6 mm, come mostrato nella Figura 2A.
2. In abEaker, acqua deionizzata calore (che rappresenta l'uso clinico di soluzione fisiologica) ad una temperatura di ~ 60 ° C.
3. Posizionare il patibolo nel bicchiere di ~ 60 ° C acqua. Utilizzare pinzette per spingere l'impalcatura di sotto della superficie dell'acqua, esponendo tutti i settori per l'acqua. Continuare per ~ 2 minuti o fino a quando il ponteggio viene notevolmente ammorbidito (Figura 2B).
4. Rimuovere il patibolo dal bicchiere e premere immediatamente (a mano) nel modello di difetto.
5. Lasciare raffreddare a RT (~ 5-10 min) (Figura 2C).
6. Rimuovere dal difetto di osservare la nuova forma provvisoria fissa e il ritorno dello stato relativamente più rigido (Figura 2D).

5. Test Memoria plasmare il comportamento

1. Utilizzando un analizzatore dinamico meccanico (DMA, ad esempio un TA Instruments Q800 qui usato), eseguire una prova di compressione deformazione controllata ciclica termica meccanica su un ponteggio in due cicli (N) per determinare la forma fissità (R _f) eforma di recupero (R _r) (Figura 3).
   1. Equilibrare a 60 ° C (T _alto) per 5 min.
   2. Comprimere una massima deformazione (ε _m = 50%) a 50% / min.
   3. Tenere a ε _m (5 min).
   4. Raffreddare a 25 ° C (T _basso) e mantenere per 10 minuti per fissare la forma temporanea.
   5. Rimuovere il carico.
   6. Misurare la deformazione ultima nello stato privo di stress (ε _u).
   7. Riscaldare a 60 ° C (T _alto) e mantenere per 10 minuti per recuperare la forma permanente.
   8. Misurare il ceppo recuperato (ε _p).
   9. Mentre ancora a 60 ° C (T _alto), avviare il ciclo ^° 2 (N = 2) comprimendo la scaffold al 50% dell'altezza recuperato dopo il 1 ^° ciclo (N = 1).
   10. Ripetere 5.1.3-5.1.8 Per N = 2.
   11. Calcolare R _f e _R r per N = 1 e 2 con le seguenti equazioni:
       R _{f (N)} = [ε _u (N) / ε _{m] R} r (N) = [ε _m - ε _p (N)] / [ε _m - ε _p (N -1)]

6. Visualizing dimensione dei pori e Pore interconnettività

1. Usando la microscopia elettronica a scansione (SEM, ad esempio, una FEI Quanta SEM usati nel presente documento), osservare la dimensione dei pori e pori interconnettività.
   1. Con una pinzetta per tenere il patibolo SMP, immergere in N liquido ₂ per 1 min.
   2. Rimuovere da N ₂ liquido e frattura lungo il centro del ponteggio con una lama di rasoio pulito.
   3. Utilizzando nastro di carbonio, apporre una delle due metà SMP scaffold sul campionein scena con la superficie fratturata rivolta verso l'alto.
   4. Sputter cappotto con Au-Pt (~ 4 nm).
   5. Acquisire l'immagine SEM ad una tensione di accelerazione consigliata di 10-15 kV (Figura 4A).

7. Prova di Bioattività in vitro

1. In una provetta da centrifuga da 50 ml, aggiungere ~ 30 ml di 1X SBF ^24.
2. Ottenere un ponteggio nella sua originale forma permanente cilindrico moulding. Tagliare il ponteggio a metà (lungo il bordo circolare) usando una lama pulita.
3. Inserire un individuo a metà patibolo nel tubo da centrifuga preparato e berretto.
4. Mantenere il tubo a 37 ° C in un bagno d'acqua in condizioni statiche senza modifiche SBF.
5. Dopo 14 giorni, rimuovere l'impalcatura dalla SBF e asciugare all'aria per 24 ore.
6. Con del nastro carbonio, apporre il patibolo sul palco del campione con la superficie fratturata rivolta verso l'alto.
7. Sputter cappotto con Au-Pt (~ 4 nm).
8. Acquisire l'immagine SEM ad un relodato tensione di accelerazione di 10-15 kV (Figura 4B).

Risultati

La risultante SMP scaffold basato PCL è in grado di auto-montaggio in un modello CMF difetto (Figura 2). Dopo una breve esposizione a caldo salina (~ 60 ° C), il patibolo cilindrica ammorbidisce permettendo al patibolo da premere manualmente in ed espandere all'interno del modello difetto. Dopo raffreddamento a RT, l'impalcatura è fissato nella sua nuova forma temporanea che è trattenuta dopo la rimozione dal difetto.

Il comportamento a memoria di forma di un pon...

Discussione

Questo protocollo descrive la preparazione di una impalcatura basato PCL polydopamine rivestite cui sé-montaggio comportamento, nonché osteoinduttività e bioattività, rende di interesse per il trattamento di difetti ossei irregolari CMF. Aspetti del protocollo può essere modificato per cambiare varie caratteristiche patibolo.

Il protocollo inizia con acrylation di un PCL-diolo per consentire cura UV. Nell'esempio riportato, il PCL-diolo M _{n è} ~ 10.000 g / mol. Tuttavia, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Triethylamine (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Acryloyl chloride	Sigma-Aldrich	A24109
Ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
Potassium carbonate (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher	M65
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Dopamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	H8502
Tris buffer (2mol/L)	Fisher	BP1759	Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve	VWR	47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA)	TA Instruments	Q800
High Resolution Sputter Coater	Cressington	208HR
Scanning Electron Microscope (SEM)	FEI	Quanta 600