مراقبة الحركة الهدبية من الخلايا المشيمية الضفيرة طلائي<em&gt; السابقين فيفو</em

Summary

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Abstract

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report¹, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Introduction

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies^2–4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus⁵ and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells⁶, and are involved in the determination of left–right asymmetry of the vertebrate body⁷.

Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia⁸. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period¹. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions⁹. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia.

With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium^5,10, motile single-cell flagella¹¹, so-called conventional motile cilia¹², and nodal cilia¹³, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed¹. Moreover, original image analysis software “TI Workbench” has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكولات واستخدام حيوانات التجارب رعاية الحيوان واستخدام اللجان المؤسسية في جامعة ياماناشي وجامعة واسيدا. وقد أجريت رعاية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

1. إعداد CPEC

1. إعداد الأجهزة والمواد التالية: المجهر ستيريو، ويفضل أن يكون قادرا على نقل الإضاءة من الأسفل. زوج من ملقط ساعاتي (دومون # 3 أو رقم 4)، تعقيم اللهب، مقص التشغيل على التوالي، تعقيم اللهب. اثنين العقيمة أطباق 10 سم من البلاستيك تحتوي على 20 مل الجليد الباردة يبوفيتش L-15 متوسطة. أطباق أسفل الزجاج 35 ملم يحتوي على 2 مل RT يبوفيتش L-15 متوسطة. كوب 100 مل تحتوي على 70٪ من الإيثانول. الجراء الماوس حديثي الولادة.
2. لفترة وجيزة تزج ماوس الأطفال حديثي الولادة في 70٪ من الإيثانول والموت ببطء بسرعة عن طريق قطع الرأس باستخدام مقص التشغيل.
3. وضع رئيس الفور في الجليد الباردة يبوفيتش L-15 متوسطة في العقيمة 10 سم ديش.
4. إزالة الجلد من calvaria باستخدام زوج من ملقط ساعاتي، وقطع فتح الجمجمة لفضح الدماغ، ومن ثم قطع الأعصاب القحفية لعزل الدماغ كله.
5. نقل الدماغ على طبق جديد يحتوي على الجليد الباردة يبوفيتش L-15 متوسطة ومراقبة تحت المجهر ستيريو، والتأكد من أن الدماغ هو مغمورة تماما في المتوسط.
6. تعيين الجانب الظهري من المخ مواجهة، وتوجيه الدماغ بحيث بصيلات الشم الموجودة في الموضع 03:00 (للأشخاص اليد اليمنى). عقد الدماغ بلطف مع ملقط في اليد اليسرى.
7. باستخدام ملقط تشريح غرامة (دومون # 3 أو رقم 4) في اليد اليمنى، وقطع الجسم الثفني وتحت لحمة يربط بين نصفي الكرة المخية، وعلى طول الشق الطولي للمخ.
8. دفع بلطف نصفي الكرة المخية بعيدا إلى الجانبين الجانبية وفضح الشق الدماغي عرضية.
9. فصل نصفي الكرة الأرضية عن طريق معسر من عشرالبريد حمة بين نصف الكرة الأرضية والمهاد.
10. سحب للخارج برفق الجانبية الضفيرة المشيمية البطين أن تعلق على الجانب الوحشي من الحصين من قبل affixa الصفيحة.
11. نقل الضفيرة المشيمية معزولة إلى 35 مم طبق زجاج القاع التي تحتوي جديدة يبوفيتش L-15 متوسطة، وتراكب على وزن (قائمة المواد) بلطف لعقد الأنسجة في المكان.

2. تصوير لايف CPEC سيليا

1. تأكيد الأشعة فوق البنفسجية السليم (UV) ومرشح الاستدلال (IR) قطع (ق) لمنع يتم إدراج ضوء أقصر من 400 نانومتر، وأطول من 700 نانومتر، والتي محايدة الكثافة (ND) مرشحات (25٪ و 6٪) في مسار الضوء المجهر المقلوب.
2. ضبط بؤرة العدسة الشيئية تقريبا بالعين، ومن ثم ضبط مكثف بحيث الوسط والتركيز لتتماشى مع إضاءة كوهلر. إدراج المقابل تدخل الفرق المناسب (DIC) موشور، وهو عنصر مدينة دبي للإنترنت، وكذلك محلل والمستقطب العناصر في ليمسار GHT لتتوافق مع البصريات DIC.
3. ضبط تباين الرأي موقف المنشور DIC ذلك أن هيكل سطح النسيج هو الأكثر تميزا. إذا كان كل أهداب الخلايا المستهدفة هي متحركة، رؤية واضحة للأهداب متحركة لا يمكن الحصول عليها عن طريق العين بسبب حركتهم.
4. تغيير مسار الضوء لكاميرا الفيديو، وإزالة مرشحات ND لزيادة قوة الضوء.
5. استخدام الكاميرا في وضع التركيز على ضبط مجال الرؤية والتركيز. خلال التركيز، حيث يتم عرض صور الفيديو في الوقت الحقيقي على شاشة العرض، ورؤية واضحة للأهداب متحركة غير متوفر.
6. استخدام الكاميرا في 200 هرتز مع ومدة التعرض من 0.1 مللي ثانية للفترة المطلوبة (ثواني إلى دقائق). بعد الحصول على صورة كومة، والأطر واحد عرض هياكل الهدبية واضحة. إذا حواف الهدبية غير واضحة، وزيادة معدل الإطار أو استخدام وقت التعرض أقصر.
7. تسجيل حركة CPEC أهداب داخل 25-60 دقيقة بعد القتل الرحيم في يبوفيتشL-15 متوسطة.

3. تحليل الهدبية الحركة

1. تتبع يدويا بفوزه على أنماط من كل هدب على شاشة الكمبيوتر. علامة مواقف الهدبية طرف في كل إطار مع مؤشر الماوس، التي يتم تجميعها للحصول على معلومات مسار كل هدب. أما تحليل المعلومات مساره باستخدام نفس البرنامج أو تصديرها إلى تطبيقات أخرى أكثر عمومية لمزيد من التحليل. يوصف كفاءة هذه الخطوة التحليل في مناقشة.
2. تصنيف مسارات إلى وضعين للحركة، ذهابا وإيابا أو التناوب، من خلال العين.
3. حساب التردد الهدبية الضرب (البرازيلي) باستخدام الصيغة التالية: [الاتحاد البرازيلي = (عدد الإطارات في الثانية) / (متوسط ​​عدد الإطارات للفوز واحد)] ^14، والتي يمكن الحصول عليها من رسم تخطيطي الهدبية طرف الحركة (الشكل 3 ). كرر هذه العملية الحسابية لعدة دورات الهدبية الضرب، لأن الأهداب الأخرى على نفس الخلية يمكن أن تتداخل مع حركة كل ciliuم، مما أدى إلى عدم انتظام.
4. لتحليل التوحيد الزاوي للالهدبية الضرب محاور داخل خلية واحدة، وتحديد θ زاوية الضرب لكل مسار (الشكل 4). لمسارات ذهابا وإيابا، تناسب المواقف من طرف أهداب إلى خط مستقيم، وتحديد θ كما زاوية خط يجعل مع x -axis. لمسارات التناوب، وتناسب المواقف إلى القطع الناقص، وتحديد θ كما زاوية محور رئيسي من القطع الناقص يجعل مع x -axis. ووصف تفاصيل المناسب في القسم ممثل النتائج.
5. لوصف كمي لكل مسار، وحساب المعمم نسبة الارتفاع AR. لفترة وجيزة، وتناوب على مسار من قبل - θ وتحديد AR كما النسبة بين الاعراض من التوزيع على طول س - و-axes ص (الشكل 4B). وترد التفاصيل في القسم ممثل النتائج، وتفسيروأهميتها، وصفت القيود المفروضة على والمعلمة في مناقشة.

4. إعداد نموذج لSEM

ملاحظة: SEM هو طريقة مهمة لتقييم وضع أهداب على CPECs بطريقة شاملة. لإعداد العينات للSEM، أفاد الإجراء القياسي السابق ¹⁵ يعمل مع تعديلات طفيفة.

1. قبل تشريح الأنسجة من الدماغ، وإعداد تثبيتي في قنينة زجاجية 5 مل مع غطاء البولي ايثيلين. يتكون تثبيتي من 2٪ امتصاص العرق، 2.5٪ غلوتارالدهيد (نصف حل Karnovsky ^ل16) في 0.1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4.
2. تشريح خارج أنسجة من المخ كما هو موضح في الخطوة 1.
3. شطف لفترة وجيزة الأنسجة المعزولة مع محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) في طبق جديد ثم إصلاح الأنسجة في تثبيتي في قارورة زجاجية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ماصات نقل المتاح والتعامل مع العينات جنرال الكتريكntly. بعد الشطف في HBSS، وتصبح الأنسجة لزجة.
   1. لنقل العينات إلى حل تثبيتي، وطرد ببطء على كمية صغيرة من محلول يحتوي على الأنسجة من ماصة نقل بمثابة قطرة وإضافة إلى تثبيتي.
4. بعد التثبيت، تجاهل تثبيتي، وشطف الأنسجة مع العازلة الفوسفات ثلاث مرات.
5. تزج النسيج في محلول السكروز 10٪ لتغسل الألدهيدات المتبقية. لضمان القضاء الكامل على الألدهيدات، تزج العينات في حل لمدة 10 دقيقة ثم كرر مرتين مع السكروز النقي 10٪. هذه الخطوة مهمة لتحقيق الصحيح بعد التثبيت في الخطوات اللاحقة.
6. تزج النسيج في محلول 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم في المخزن الفوسفات لمدة 30 دقيقة ثم ضع على الجليد لمرحلة ما بعد التثبيت. الحكم على درجة من المعاملة بالأوزميك من لون عينة: عندما تتم إزالة الألدهيدات تماما، وعينة سوداء.
7. غسل الأنسجة عينات ثابتة آخر على نطاق واسع مع مقطر مزدوجد الماء عدة مرات.
8. يذوى العينات عن طريق الغمر في تركيزات متدرجة من الإيثانول، عادة 65٪، 75٪، 85٪، 95٪، 99٪، و 100٪، لمدة 10 دقيقة لكل منهما. الحصول على الايثانول اللامائي من خلال وضع المناخل الجزيئية إلى 99.5٪ من الإيثانول من زجاجة شراؤها حديثا. تكرار الجفاف مع اللامائية الإيثانول ثلاث مرات.
9. وضع العينات المجففة في خلات الأميل، كاشف استبدال لتجفيف نقطة حرجة، لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين. هذا كاشف يتبخر بسرعة ويمكن أن تصبح العينة الجافة، مما أدى إلى تدمير التوتر السطحي. ولذلك، لا تجف العينة تماما.
10. بعد تبادل النهائي من خلات الأميل، وإزالة معظم المذيبات، وعلى الفور التفاف قارورة زجاجية مفتوحة مع رقائق الألومنيوم، ووضع قنينة على الثلج الجاف. باستخدام إبرة أو ملقط غرامة، وجعل عدة ثقوب في احباط تغطية الفم من القارورة، بحيث يتدفق ثاني أكسيد الكربون السائل بسهولة إلى القارورة في مجفف نقطة حرجة. انتقل إلى الخطوة التاليةباسرع ما يمكن.
11. في هذه الخطوة، والتقليل من المرحل من خلات الأميل في الغرفة مجفف، ولكن لا تدع العينة تجف تماما قبل التجفيف نقطة حرجة. وبالإضافة إلى ذلك، لا تترك العينة على الثلج الجاف لفترة طويلة دون داع لتجنب تشكيل الصقيع على القارورة.
12. نقل قوارير زجاجية ملفوفة احباط تحتوي على عينات الأنسجة إلى مجفف نقطة الأهمية بمكان أن يضمن بنية سطح الأنسجة لا تزال سليمة في حين إزالة المياه الوارد في الأنسجة. يمكن الحصول على معلومات مفصلة عن تشغيل مجفف نقطة حرجة من تعليمات الشركة الصانعة.
13. التعامل مع العينات بعناية باستخدام المسواك لتقليل الأضرار الميكانيكية. ينتج عن ذلك من عينات الأنسجة المجففة هشة. جبل العينات على بذرة المعادن ومعطف مع الذهب والبلاديوم استخدام تفل أيون.

5. مراقبة من قبل SEM

1. مراقبة من قبل SEM وتسجيل الصور مع كاميرا رقميةمجهزة لالمجهر الإلكتروني الماسح.
2. نقل بيانات الصور الرقمية إلى جهاز كمبيوتر لتحليلها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويظهر لمحة عامة عن سير العمل في الشكل 1، بما في ذلك الصور من الأجهزة.

ملاحظات الحركة الحية من CPECs

فيلم 1 يظهر الفيلم من CPECs معزولة عن ماوس فترة ما حول الولادة، وفيلم 2 ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وجهات النظر هذه الطريقة

على الرغم من أن تقنية الموضحة هنا لا تقدم تحليلا أكثر تفصيلا للأهداب من الطرق التي تم نشرها مسبقا، وأهمية هذه التقنية تكمن في بساطة النظام والفعالية من حيث التكلفة، والتي يمكن تطبيقها بسهولة على فحص أي نو?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice
[header]
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2
[header]
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510