Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem<em&gt; Ex Vivo</em

Özet

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Özet

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report¹, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Giriş

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies^2–4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus⁵ and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells⁶, and are involved in the determination of left–right asymmetry of the vertebrate body⁷.

Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia⁸. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period¹. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions⁹. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia.

With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium^5,10, motile single-cell flagella¹¹, so-called conventional motile cilia¹², and nodal cilia¹³, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed¹. Moreover, original image analysis software “TI Workbench” has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

protokoller ve Deney hayvanlarının kullanımı Yamanashi ve Waseda Üniversitesi Üniversitesi'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından onaylandı. Hayvan bakımı, kurumsal prensiplere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. CPEC Hazırlık

1. Aşağıdaki cihazlar ve malzemeleri hazırlayın: alttan aydınlatma iletilmesi tercihen bir stereo mikroskop; saatçi forseps bir çift (Dumont # 3 ya da # 4), alev sterilize düz işletim makas, alev sterilize; 20 ml buz gibi soğuk Leibovitz L-15 ihtiva eden ortam, iki steril 10 cm'lik plastik tabaklar; 2 ml RT Leibovitz L-15 orta içeren 35 mm cam alt yemekler; % 70 etanol içeren 100 ml'lik bir beher; yenidoğan fare yavrular.
2. Kısaca% 70 etanol içinde bir yenidoğan fare batırmak ve işletim makas kullanarak kafaları kesilmek suretiyle hızla euthanize.
3. Steril 10 cm di buz Leibovitz L-15 orta derhal baş koyunsh.
4. Beyin maruz kafatası açmak kesip, saatçi forseps çifti kullanarak calvaria cildi çıkarın ve ardından tüm beyni izole etmek için kranial sinirler kesilir.
5. Buz soğukluğunda Leibovitz L-15 ortamı içeren yeni bir çanak beyin aktarın ve beyin tam ortam içinde daldırılır emin, stereo bir mikroskop altında dikkate alınmalıdır.
6. Yukarı bakacak şekilde beynin dorsal yönünü ayarlayın ve koku ampuller (sağ-elli kişilik) 03:00 konumundaki ikamet böylece beyin yönlendirmek. Sol elinde forseps ile yavaşça beyin tutun.
7. İnce diseksiyon forseps (Dumont # 3 ya da # 4) sağ elinde kullanarak, beyin uzunlamasına fissür boyunca, serebral hemisfer bağlayan korpus kallosum ve parankiminde altında kesti.
8. Nazikçe yan taraflarına serebral hemisferlerin itin ve enine serebral fissür maruz kalmaktadır.
9. Th dışarı kısma hemisferlerin ayırınhemisfer ve talamus arasındaki e parankim.
10. Yavaşça lamina affixa ile hipokampus yan tarafına bağlı olduğu yanal ventriküler koroid pleksus çekin.
11. Taze Leibovitz L-15 orta içeren 35 mm cam alt çanak izole koroid pleksus aktarın ve ağırlığı (Malzeme Listesi) yavaşça yerine doku tutun kaplaması.

CPEC Cilia 2. Canlı Görüntüleme

1. 400 nm ve daha uzun 700 nm ve bu nötr yoğunluk (ND) filtreleri (% 25 ve% 6) daha kısa ışık ışık yolu eklenir engellemek için uygun ultraviyole (UV) ve anlaşıldığı (IR) kesim filtresi (ler) Onay ters mikroskop.
2. Kabaca gözle objektif lens odağını ayarlayın ve merkez ve odak Köhler aydınlatma uyacak, böylece daha sonra yoğuşturucuyu ayarlayın. Uygun bir diferansiyel girişim kontrast kaydedin (DIC) prizma, li bir DIC elemanı, hem de analiz ve polarize elemanlarght yolu DIC optik uymak.
3. Doku yüzeyinin yapısı en tanınabilir şekilde DIC prizma pozisyonu ile görüş kontrastını ayarlayın. Hedef hücrelerin her kirpikler hareketli iseniz, hareketli kirpikler net bir görünüm nedeniyle hareket gözle elde edilemez.
4. Video kamera ışık yolu değiştirin ve ışık gücünü artırmak için ND filtreleri kaldırabilirsiniz.
5. Görünümü ve odak alanını ayarlamak için mod odaklama kamerayı kullanın. Hangi video görüntüleri monitörde gerçek zamanlı olarak gösterilir, odaklama sırasında, hareketli kirpikler net bir görünüm mevcut değildir.
6. İstenilen süre (dakika saniye) 0,1 msn bir pozlama süresi ile 200 Hz kamerayı kullanın. Görüntü yığınının kazanılmasından sonra, tek kare net siliyer yapıları gösterecektir. Siliyer kenarları bulanık ise, kare hızını artırmak ya da daha kısa bir pozlama süresi kullanın.
7. Leibovitz içinde ötenazi sonra 25-60 dakika içinde CPEC kirpikler hareketini kaydedinL-15 ortamı.

Silier Hareketinin Analizi 3.

1. El ile bilgisayar monitöründe her cilium kalıplarını yenerek izleyebilirsiniz. Her cilium yörünge bilgisi için monte edilen fare işaretçisi, her karede Mark silier ucu pozisyonları. Ya daha fazla analiz için diğer daha genel uygulamalara aynı yazılımı veya ihracat kullanarak yörünge bilgileri analiz. Bu analiz, aşama verimi Tartışma tarif edilmektedir.
2. Gözle hareket iki mod, geri ve ileri-veya dönme içine yörüngeleri sınıflandırır.
3. Aşağıdaki formülü kullanarak siliyer dayak frekansı (CBF) hesaplayın: [CBF = (saniyedeki kare sayısı) / (Tek beat için kare ortalama sayısı)], bir siliyer ucu hareket şemasında elde edilebilir ^14, (Şekil 3 ). Aynı hücrede başka kirpikler, her ciliu hareketi engelleyebilir, çünkü, birden fazla siliyer çırpma döngüsü için bu hesaplama tekrarlayınm, düzensizlik ile sonuçlanır.
4. Tek bir hücrenin içinde eksenleri yenerek ciliary açısal tekdüzelik analiz etmek, her yörünge (Şekil 4) için dayak açısı θ tanımlar. Geri ve ileri-yörüngeleri için, düz bir çizgi kirpikler ucu pozisyonlarını uygun ve satır x -Axis ile yapar açı olarak θ tanımlar. Rotasyonel yörüngeleri, bir elips pozisyonları uygun ve elipsin büyük eksen x -Axis ile yapar açı olarak θ tanımlar. Fitingin ayrıntıları Örnek Sonuçlar bölümünde tarif edilmektedir.
5. Her yörüngenin kantitatif açıklaması için, genelleştirilmiş boy oranı AR hesaplayın. Kısaca, göre yörünge döndürme - θ ve X boyunca dağılımının genişliğine arasındaki oran olarak AR tanımlar - ve y -axes (Şekil 4B). Detaylar Temsilcisi Sonuçlar bölümünde gösterilen ve yorumlama vardır, Önemi ve parametre sınırlama Tartışma açıklanmıştır.

SEM 4. Numune Hazırlama

Not: SEM kapsamlı bir şekilde CPECs üzerinde kirpikler durumunu değerlendirmek için önemli bir yöntemdir. SEM için örnekler hazırlamak için, standart bir prosedür daha önce ¹⁵ hafif değişiklikler kullanılmaktadır bildirdi.

1. Beyin dokusu kesme önce, bir polietilen bir kap ile 5 ml'lik bir cam şişe içinde fiksatif hazırlar. sabitleyici% 2 paraformaldehid, 0.1 M fosfat tampon maddesi, pH 7.4 içinde% 2.5 glutaraldehid (yarım Karnovsky çözeltisi ¹⁶⁾ oluşur.
2. 1. adımda anlatıldığı gibi beyin doku parçalara ayır.
3. Kısaca, yeni bir tabağına Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile izole edilmiş doku yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir cam şişe içinde sabitleyici doku tamir. Tek kullanımlık transferi pipetler kullanın ve örnekleri ge koluntly. HBSS içinde durulama sonra, doku yapışkan hale gelir.
   1. Sabitleyici çözeltisi içine örnekleri aktarmak için yavaş bir damlacık olarak transfer pipeti doku ihtiva eden bir çözelti, az miktarda dışarı atılması ve sabitleştirici ekleyin.
4. Tespit edildikten sonra, Fiksatif atmak ve fosfat tamponu ile üç kez doku durulayın.
5. Kalan aldehit yıkamak için% 10 sukroz çözeltisi doku daldırın. Aldehitlerin tamamen ortadan kaldırılmasını sağlamak 10 dakika boyunca çözelti içinde numune sokmak ve daha sonra, taze,% 10 sakaroz ile iki kez tekrarlayın. Bu adım, daha sonraki kademelerde, uygun post-fiksasyon elde etmek için önemlidir.
6. 30 dakika boyunca fosfat tamponu içinde% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi içinde doku daldırın ve sonrası sabitleme için buz üzerine yerleştirin. Numune rengine göre osmification derecesini Yargıç: aldehitler tamamen kaldırıldığında, örnek siyahtır.
7. Çift damıtılmış ile yoğun sonradan tespit doku örnekleri yıkayınd suyu birkaç kez.
8. Kademeli derişimlerde etanol içine daldırma ile örnekleri kurutmak, genellikle,% 65,% 75,% 85,% 95,% 99 ve% 100, 10 dakika her biri için. Yeni satın alınan şişe% 99.5 etanol içine moleküler elekler koyarak susuz etanol elde edilir. Susuz etanol ile üç kez dehidratasyon tekrarlayın.
9. 10 dakika boyunca, izoamil asetat, kritik nokta kurutma için bir ikame reaktifine susuz numuneler. İki kez bu adımı yineleyin. Bu reaktif hızla buharlaşır ve örnek yüzey gerilimi tarafından imha sonuçlanan kuru olabilir. Bu nedenle, tamamen kurumasını örnek yok.
10. Izoamil asetat nihai değişimi hemen sonra, çözücünün büyük bir kısmının çıkarılması, alüminyum folyo ile açık cam şişe kaydırmak ve kuru buz üzerinde şişe yerleştirin. Sıvı karbon dioksit, kritik nokta kurutma şişenin içine kolay akar, böylece bir iğne ya da ince forseps kullanılarak, şişenin ağzını kapsayan folyo çok delik açmak. Sonraki adıma geçinolabildiğince çabuk.
11. Bu adımda, kurutma odasına isoamil asetat taşınmasını en aza indirmek, ancak numune tamamen kritik nokta kurutmadan önce kurumaya izin vermeyin. Buna ek olarak, şişe üzerindeki don oluşumunu önlemek için gereğinden uzun bir süre boyunca kuru buz üzerinde örnek bırakmaz.
12. Çıkarmadan su dokusunda bulunan iken doku yüzey yapısı bozulmadan kalır sağlayan kritik nokta kurutucu içine doku örnekleri içeren folyo sarılı cam şişeleri aktarın. Kritik nokta kurutma işletim ile ilgili detaylı bilgiler üreticinin talimatlarına elde edilebilir.
13. Dikkatle mekanik zararı en aza indirmek için bir kürdan kullanarak örnekleri taşıyınız. Elde edilen kurutulmuş doku örnekleri kırılgandır. Bir iyon püskürtmeye kullanarak altın paladyum metal taslakları ve ceket örnekleri monte edin.

SEM ile 5. Gözlem

1. SEM ile gözlemleyin ve bir dijital kamera ile görüntüleri kaydedebilirsiniztaramalı elektron mikroskobu ile donatılmış.
2. Analiz için bir bilgisayara dijital görüntü verilerini aktarın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Iş akışının bir bakış cihazları görüntü dahil olmak üzere Şekil 1 'de gösterilmiştir.

CPECs Canlı hareket gözlemleri

Film 1 Bir perinatal fare izole CPECs bir film gösterir ve Film 2 Film 1 görüntüleri genişletilmiş bir görünümünü gösterir. Bireysel siliyer ipuçları filmlerde kıyasla hareketsiz görüntülerde daha az net olduğunu belirtmek gerekir. 2 gösteri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yöntemin Perspektifler

Burada açıklanan teknik daha önce yayınlanmış yöntemlere göre silya daha ayrıntılı bir analiz sağlamak olmamasına rağmen, bu tekniğin önemi kolayca siliyer hareketlilik ex vivo her türlü tarama uygulanabilir sistem ve maliyet etkinliği, sadeliği bulunur. Özellikle, TI Workbench gözlemlemek ve daha kolay siliyer hareketliliğini analiz araştırmacıları sağlayan basit ve kullanıcı dostu bir arayüz sağlar. Etkili otomatik izleme ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice
[header]
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2
[header]
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510