L&#39;osservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide<em&gt; Ex Vivo</em

Riepilogo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Abstract

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report¹, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Introduzione

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies^2–4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus⁵ and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells⁶, and are involved in the determination of left–right asymmetry of the vertebrate body⁷.

Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia⁸. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period¹. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions⁹. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia.

With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium^5,10, motile single-cell flagella¹¹, so-called conventional motile cilia¹², and nodal cilia¹³, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed¹. Moreover, original image analysis software “TI Workbench” has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

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Protocollo

I protocolli e l'uso di animali da esperimento sono stati approvati dalla cura degli animali e l'uso dei comitati istituzionali presso l'Università di Yamanashi e Waseda University. La cura degli animali è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali.

1. CPEC Preparazione

1. Preparare i seguenti apparati e materiali: un microscopio stereo, preferibilmente in grado di trasmettere illuminazione dal basso; un paio di pinze da orologiaio (Dumont # 3 o # 4), sterilizzata fiamma, forbici operativi diritte, sterilizzato fiamma; due sterili piatti 10 centimetri di plastica contenenti 20 ml ghiacciata Leibovitz L-15; 35 millimetri piatti con fondo di vetro, contenenti 2 ml di RT Leibovitz L-15; un becher da 100 ml contenente 70% di etanolo; cuccioli neonatali mouse.
2. Brevemente immergere un mouse neonatale in 70% di etanolo e eutanasia rapidamente decapitazione utilizzando le forbici operativi.
3. Mettere subito la testa in gelida Leibovitz L-15 di media sterile 10 centimetri dish.
4. Togliere la pelle dai calvaria utilizzando la coppia di pinze orologiaio, tagliare aprire il cranio per esporre il cervello, e quindi tagliare i nervi cranici per isolare tutto il cervello.
5. Trasferire il cervello per un nuovo piatto contenente ghiacciata Leibovitz L-15 a medio e osservare al microscopio stereo, facendo in modo che il cervello è completamente immerso nel mezzo.
6. Impostare la parte dorsale del cervello rivolto verso l'alto, e orientare il cervello in modo che i bulbi olfattivi risiedono nella posizione 03:00 (per le persone destri). Tenere il cervello leggermente con le pinzette nella mano sinistra.
7. Utilizzando le pinze dissezione fini (Dumont # 3 o 4 #) nella mano destra, tagliare il corpo calloso e sotto il parenchima che collega gli emisferi cerebrali, lungo la fessura longitudinale del cervello.
8. Spingere delicatamente gli emisferi cerebrali via ai fianchi laterali ed esporre la fessura cerebrale trasversale.
9. Separare gli emisferi pizzicando fuori the parenchima tra l'emisfero e talamo.
10. Estrarre delicatamente i laterali plesso coroideo ventricolari che è attaccato alla parte laterale dell'ippocampo dal Affixa lamina.
11. Trasferire i isolati plesso coroideo al piatto fondo di vetro 35 millimetri contenente fresco Leibovitz L-15 di media, e sovrapporre un peso (Materials List) delicatamente per tenere il tessuto in luogo.

2. Immagini dal vivo di CPEC Cilia

1. Verificare il corretto raggi ultravioletti (UV) e il filtro dedotto (IR) taglio (s) per bloccare luminosa inferiore a 400 nm e più di 700 nm, e che a densità neutra (ND) Filtri (25% e il 6%), sono inseriti nel percorso di luce del microscopio invertito.
2. Regolare la messa a fuoco della lente obiettivo rudemente per occhio, e quindi regolare il condensatore in modo che il centro ed il fuoco per conformarsi alla illuminazione Köhler. Inserire un contrasto interferenziale differenziale appropriata (DIC) prisma, un elemento DIC, nonché analizzatore e polarizzatore elementi in lipercorso ght di conformarsi alle ottiche DIC.
3. Regolare il contrasto di vista dalla posizione del prisma DIC modo che la struttura della superficie del tessuto è più riconoscibile. Se tutti cilia delle cellule bersaglio sono mobili, una chiara visione di ciglia motile non può essere ottenuta con occhio a causa del loro movimento.
4. Modificare il percorso della luce per la videocamera, e rimuovere i filtri ND per aumentare la potenza della luce.
5. Usare la fotocamera in modalità di messa a fuoco per regolare il campo visivo e messa a fuoco. Durante la messa a fuoco, in cui le immagini video vengono visualizzati in tempo reale sul monitor, una chiara visione di ciglia motilità non è disponibile.
6. Usare la fotocamera a 200 Hz con un tempo di esposizione di 0,1 ms per il periodo desiderato (secondi a minuti). Dopo l'acquisizione della pila di immagini, singoli fotogrammi visualizzeranno strutture ciliari chiare. Se i bordi ciliari sono sfocate, di aumentare la frequenza dei fotogrammi o utilizzare un tempo di esposizione più breve.
7. Registrare il movimento di CPEC ciglia entro 25-60 minuti dopo l'eutanasia in LeibovitzL-15.

3. Analisi del Movimento ciliare

1. Tenere traccia manualmente battendo i modelli di ogni ciglio sul monitor del computer. Segna posizioni punta ciliare in ogni fotogramma con il puntatore del mouse, che vengono assemblati per informazioni traiettoria di ogni ciglio. O analizzare le informazioni traiettoria con lo stesso software o esportare in altre applicazioni più generali per ulteriori analisi. L'efficienza di questa fase di analisi è descritto nella discussione.
2. Classificare le traiettorie in due modalità di movimento, avanti e indietro o di rotazione, a occhio.
3. Calcolare la frequenza battito ciliare (CBF) utilizzando la seguente formula: [CBF = (numero di fotogrammi al secondo) / (numero medio di frame per un singolo battito)] ^14, che può essere ottenuto da un diagramma di moto punta ciliare (Figura 3 ). Ripetere questo calcolo per più cicli battito ciliare, perché altra cilia sulla stessa cella può interferire con il movimento di ciascun cilium, con conseguente irregolarità.
4. Per analizzare l'uniformità angolare del battito ciliare assi all'interno di una singola cella, definire l'angolo θ battitura per ogni traiettoria (Figura 4). Per traiettorie indietro e indietro, misura le posizioni della punta cilia a una linea retta, e definire θ come l'angolo del segmento fa con asse x. Per traiettorie rotazionali, montare le posizioni ad un'ellisse, e definire θ come l'angolo l'asse maggiore dell'ellisse fa con asse x. I dettagli del montaggio sono descritti nella sezione risultati rappresentativi.
5. Per una descrizione quantitativa di ogni traiettoria, calcolare generalizzata proporzioni AR. Brevemente, ruotare la traiettoria - θ e definire AR come il rapporto tra le larghezze della distribuzione lungo x - e -axes y (Figura 4B). I dettagli sono indicati nella sezione risultati rappresentativi, e l'interpretazione, Significato, e la limitazione del parametro sono descritti nella discussione.

4. Preparazione del campione per SEM

Nota: SEM è un metodo importante per valutare lo stato delle ciglia su CPECs in modo globale. Per preparare campioni per SEM, una procedura standard riportato in precedenza ¹⁵ viene impiegato con lievi modifiche.

1. Prima sezionare il tessuto dal cervello, preparare il fissativo in una fiala di vetro da 5 ml con tappo in polietilene. Il fissativo contiene il 2% paraformaldeide, glutaraldeide al 2,5% (metà soluzione Karnovsky ¹⁶⁾ in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4.
2. Sezionare il tessuto dal cervello come descritto al punto 1.
3. Brevemente sciacquare il tessuto isolato con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) in un nuovo piatto e quindi fissare il tessuto nella fissante nella fiala di vetro per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare pipette monouso e trattare i campioni gente. Dopo lavaggio in HBSS, il tessuto diventa appiccicoso.
   1. Per trasferire i campioni nella soluzione fissativo, lentamente espellere una piccola quantità di soluzione contenente il tessuto dalla pipetta di trasferimento come una gocciolina e aggiungere al fissativo.
4. Dopo la fissazione, scartare il fissativo e lavare il tessuto con tampone fosfato tre volte.
5. Immergere il tessuto in una soluzione di saccarosio al 10% per lavare i restanti aldeidi. Per assicurare l'eliminazione completa aldeidi, immergere i campioni nella soluzione per 10 minuti e quindi ripetere due volte con fresca 10% di saccarosio. Questo passaggio è importante per una buona post-fissazione in fasi successive.
6. Immergere il tessuto in una soluzione di 1% tetrossido di osmio in tampone fosfato per 30 min e poi posto su ghiaccio per post-fissazione. Giudicare il grado di osmification dal colore del campione: quando aldeidi vengono completamente rimossi, il campione è nero.
7. Lavare i campioni di tessuto post- fisso a lungo con doppio distilled acqua più volte.
8. Disidratare i campioni di immersione in concentrazioni graduati di etanolo, generalmente 65%, 75%, 85%, 95%, 99% e 100%, per 10 minuti ciascuno. Ottenere etanolo anidro inserendo setacci molecolari in 99,5% di etanolo da una bottiglia appena acquistato. Ripetere disidratazione con etanolo anidro tre volte.
9. Porre i campioni disidratati in acetato di isoamile, un reagente di sostituzione per punto essiccazione critico, per 10 min. Ripetere questa operazione due volte. Questo reagente evapora rapidamente e il campione può diventare secca, con conseguente distruzione dalla tensione superficiale. Pertanto, non asciugare completamente il campione.
10. Dopo l'ultimo scambio di acetato isoamile, rimuovere la maggior parte del solvente, immediatamente avvolgere la fiala di vetro aperto con un foglio di alluminio, e posizionare il flacone in ghiaccio secco. Utilizzando un ago o una pinza sottile, fare diversi fori nella pellicola che copre la bocca del flacone, in modo che l'anidride carbonica liquida scorre facilmente nel flaconcino nel punto dryer critica. Passare alla fase successivail più rapidamente possibile.
11. In questa fase, ridurre al minimo il riporto di acetato isoamile nella camera del phon, ma non lasciare che il campione asciughi completamente prima del punto di essiccazione critico. Inoltre, non lasciare il campione sul ghiaccio secco per un tempo inutilmente lungo per evitare la formazione di brina sulla fiala.
12. Trasferire le fiale di vetro imballati in pellicola contenenti i campioni di tessuto nel punto dryer critico che assicura la struttura superficiale del tessuto rimane intatto mentre l'acqua contenuta nella rimozione del tessuto. Informazioni dettagliate sul funzionamento del punto asciugatrice critica può essere ottenuto dalle istruzioni del produttore.
13. Maneggiare con cura i campioni con uno stuzzicadenti per ridurre al minimo i danni meccanici. I campioni di tessuto derivanti secche sono fragili. Montare i campioni sul stub metallo e cappotto d'oro-palladio utilizzando una polverizzazione ionica.

5. Osservazione al SEM

1. Osservare da SEM e registrare immagini con una fotocamera digitaleattrezzato per microscopio elettronico a scansione.
2. Trasferire i dati delle immagini digitali ad un PC per l'analisi.

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Risultati

Una panoramica del flusso di lavoro è mostrata in Figura 1, comprese le immagini dei dispositivi.

Osservazioni dal vivo di movimento di CPECs

Film 1 mostra un film di CPECs isolati da un topo perinatale e film 2 mostra una vista espansa delle immagini in film 1. Va notato che i singoli suggerimenti ciliari sono meno chiari in immagini fisse rispetto a quelli in film. La Figura 2...

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Discussione

Prospettive di questo metodo

Sebbene la tecnica qui descritta non fornisce un'analisi più dettagliata delle ciglia rispetto ai metodi precedentemente pubblicati, il significato di questa tecnica risiede nella semplicità del sistema ed economicità, che può essere facilmente applicato a qualsiasi tipo di screening di motilità ciliare ex vivo. In particolare, TI Workbench fornisce un'interfaccia semplice e user-friendly che consente ai ricercatori di osservare e analizzare...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice
[header]
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2
[header]
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510