脈絡叢上皮細胞の繊毛運動の観測<em&gt;エクスビボ</em

要約

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

要約

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report¹, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

概要

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies^2–4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus⁵ and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells⁶, and are involved in the determination of left–right asymmetry of the vertebrate body⁷.

Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia⁸. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period¹. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions⁹. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia.

With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium^5,10, motile single-cell flagella¹¹, so-called conventional motile cilia¹², and nodal cilia¹³, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed¹. Moreover, original image analysis software “TI Workbench” has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

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プロトコル

プロトコルおよび実験動物の使用は、山梨と早稲田大学大学の制度的動物のケアと使用委員会によって承認されました。動物のケアは、機関のガイドラインに従って行いました。

1. CPEC準備

1. 次の装置と材料を準備します。実体顕微鏡下から照明を送信できることが好ましいです。時計屋のピンセット（デュモン＃3または＃4）、火炎滅菌し、ストレート操作はさみ、火炎滅菌。 20ミリリットルの氷冷リーボビッツL-15培地を含む2の滅菌10cmのプラスチック皿; 2ミリリットルRTリーボビッツL-15培地を含む35mmのガラスボトムディッシュ。 70％エタノールを含有する100mLのビーカー。新生児仔マウス。
2. 簡単に言えば、70％エタノールで新生児マウスを浸すとオペレーティングはさみを使用して断頭により迅速に安楽死させます。
3. 滅菌10cmのディで氷冷リーボビッツL-15培地中ですぐに頭を置きSH。
4. 脳を露出するために頭蓋骨を開いてカットし、時計屋のピンセットを使用して、頭蓋冠から肌を削除し、全脳を分離するために脳神経をカット。
5. 氷冷リーボビッツL-15培地を含む新しい皿に脳を転送し、脳が完全に媒体に浸漬されることを確認して、実体顕微鏡下で観察します。
6. 上向きに脳の背側面を設定し、嗅球（右利きの人のために）3時の位置に存在するように脳を向けます。左手にピンセットで軽く脳を持ちます。
7. 細かい解剖鉗子（デュモン＃3または＃4）右手にを使用して、大脳の縦裂に沿って、大脳半球をつなぐ脳梁と実質の下をカット。
8. 静かに側面への大脳半球を押して横断脳亀裂を公開します。
9. 目をつまんで半球を分離半球と視床間の電子の実質。
10. ゆっくりラミナaffixaによって海馬の側面に取り付けられている横心室脈絡叢を引き出します。
11. 新鮮リーボビッツL-15培地を含む35mmのガラスボトムディッシュに分離された脈絡叢を移し、重量（材料リスト）静かな場所に組織を保持するためにオーバーレイ。

CPEC繊毛の2ライブイメージング

1. 適切な紫外線（UV）と推論（IR）を確認して400nmから700nmのより長いより短い光を遮断するフィルタを切断し、その中性濃度（ND）フィルタ（25％および6％）を光路に挿入されています倒立顕微鏡の。
2. おおよその目で、対物レンズの焦点を調整し、中心となるよう冷却器を調整し、ケーラー照明に適合するように焦点を当てています。李に適切な微分干渉コントラスト（DIC）プリズム、DICの要素だけでなく、分析器と偏光子の要素を挿入しますDIC光学系に適合するGHTパス。
3. 組織表面の構造が最も認識可能であるように、DICプリズム位置によってビューのコントラストを調整します。標的細胞の全ての繊毛運動がある場合は、運動性繊毛のクリアな視界は、その動きを目では得られません。
4. ビデオカメラに光路を変更し、光パワーを増大させるためにNDフィルタを削除します。
5. ビューとフォーカスのフィールドを調整するフォーカスモードでカメラを使用してください。ビデオ画像をモニタにリアルタイムで表示される、フォーカスの際、運動性繊毛のクリアな視界は使用できません。
6. 所望の期間（数秒から数分）、0.1ミリ秒の露光時間で200 Hzでカメラを使用してください。画像スタックを取得した後、単一のフレームが明確な繊毛構造が表示されます。繊毛エッジがぼやけている場合は、フレームレートを増加させるか、より短い露光時間を使用します。
7. リーボビッツに安楽死の後、25〜60分以内にCPECの繊毛の動きを記録L-15培地。

毛様体運動の3分析

1. 手動でコンピュータのモニタ上の各繊毛のパターンを破って追跡します。各繊毛の軌跡については、組み立てられて、マウスポインタ、各フレーム内のマーク繊毛先端位置。いずれかのさらなる分析のために他のより一般的なアプリケーションに同じソフトウェアまたはエクスポートを使用して軌跡情報を分析。この分析工程の効率を議論に記載されています。
2. 目で、前後または回転、運動の二つのモードに軌道を分類します。
3. 以下の式を使用して繊毛拍動周波数（CBF）を計算する：[CBF =（秒あたりのフレーム数）/（シングルビート用フレームの平均数）]繊毛先端動作図から得ることができる^14（ 図3 ）。同じセル上の他の繊毛は、各ciliuの動きを妨げる可能性があるため、複数の繊毛運動サイクルのため、この計算を繰り返しますM、凹凸が生じます。
4. 単一セル内の軸を破って、毛様体の角度均一性を分析するために、各軌道のための鼓動角度θ（ 図4）を定義します。前後の軌道は、直線に繊毛の先端の位置に合わせて、ラインがx軸となす角度としてθを定義します。回転軌跡は、楕円に位置に合わせて、楕円の長軸がx軸となす角度としてθを定義します。フィッティングの詳細は代表的な結果のセクションに記載されています。
5. 各軌道の定量的な説明については、一般的なアスペクト比ARを計算します。簡単に言うと、によって軌道を回転させる- θとXに沿っ分布の幅の比率としてARを定義-とy -axes（ 図4B）。詳細は代表的な結果のセクションに示した、と解釈されています、重要性、およびパラメータの制限が議論に記載されています。

SEM 4.サンプル調製

注：SEMは総合的にCPECsに繊毛の状態を評価するための重要な方法です。 SEM用の試料を調製するために、標準的な手順は、以前に^15がわずかな修正で採用されていると報告しました。

1. 脳から組織を切開する前に、ポリエチレンキャップを5mLのガラスバイアル中で固定液を準備します。固定液を2％パラホルムアルデヒド、0.1Mリン酸緩衝液、pH 7.4中の2.5％グルタルアルデヒド（半Karnovskyの溶液^16）からなります。
2. ステップ1で説明したように、脳からの組織を解剖。
3. 簡単に言えば、新しい皿中ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で単離された組織をリンスした後、室温で1時間ガラスバイアルに固定液で組織を固定します。使い捨て転送ピペットを使用し、試験片GEを扱いますntly。 HBSSで洗浄した後、組織がべたつきます。
   1. 固定液に検体を転送するには、ゆっくりと滴としてトランスファーピペットからの組織を含む少量の溶液を排出し、固定液に加えます。
4. 固定後、固定液を廃棄し、リン酸緩衝液で3回組織をすすぎます。
5. 残りのアルデヒド類を洗浄するために、10％ショ糖溶液の組織を浸します。アルデヒドの完全な除去を確実にするために、新鮮な10％​​のスクロースを二回繰り返した後、10分間、溶液中に試料を浸漬し、。このステップは、後の工程で、適切後固定を達成することが重要です。
6. 30分間、リン酸緩衝液中の1％四酸化オスミウムの溶液に組織を浸漬した後、ポスト固定氷上に置きます。サンプル色によってオスミウム酸染色法の程度を判断する：アルデヒドが完全に除去されている場合、サンプルは黒です。
7. ダブルdistilleで広範囲に後固定した組織試料を洗浄Dの水で数回。
8. エタノールの濃度を段階的に浸漬することによって試料を脱水、通常、65％、75％、85％、95％、99％、100％、10分それぞれについて。新しく購入したボトルから99.5％エタノールにモレキュラーシーブを配置することによって無水エタノールを得ます。無水エタノールで3回脱水を繰り返します。
9. 10分間、酢酸イソアミル、臨界点乾燥の置換試薬に脱水サンプルを置きます。二回、この手順を繰り返します。この試薬は迅速に蒸発し、試料が表面張力によって破壊をもたらす、ドライになることができます。したがって、試料を完全に乾燥させません。
10. 酢酸イソアミルの最終交換の後、直ちにアルミホイルで開放ガラスバイアルをラップし、ドライアイス上にバイアルを置き、大部分の溶媒を除去します。液体二酸化炭素は、臨界点乾燥機にバイアル内に容易に流れるように、針や細かい鉗子を使用して、バイアルの口を覆うホイルにいくつかの穴を作ります。次のステップに進んでください可能な限り迅速に。
11. この工程では、乾燥機のチャンバー内に酢酸イソアミルのキャリーオーバーを最小限に抑えるが、サンプルが完全に臨界点乾燥の前に乾燥させてください。また、バイアルに霜の形成を回避するために、不必要に長い時間のために、ドライアイス上のサンプルを放置しないでください。
12. 組織に含まれる水分を除去しながら、組織の表面構造は無傷のまま確実に臨界点乾燥機に組織サンプルを含むアルミホイルにくるまれたガラスバイアルを転送します。臨界点乾燥機を動作に関する詳細情報は、製造業者の説明書から得ることができます。
13. 慎重に機械的損傷を最小限にするためにつまようじを使用してサンプルを処理します。得られた乾燥組織サンプルが壊れやすいです。イオンスパッタを用いて、金 - パラジウムの金属スタブとコート上のサンプルをマウントします。

SEMによる観察5.

1. SEMで観察し、デジタルカメラで画像を記録走査型電子顕微鏡に搭載しました。
2. 分析のためにPCにデジタル画像データを転送します。

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結果

ワークフローの概要は、装置の画像を含む、 図1に示されています。

CPECsのライブの動きの観察

映画1は、周産期のマウスから単離したCPECsの映画を示しており、 ムービー2ムービー1の画像の拡大図を示している。それは、個々の繊毛の先端は映画のものと比較して、静止画ではあまり明確であることに留意すべ?...

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ディスカッション

この方法の展望

ここに記載された技術は、以前に公開された方法よりも繊毛のより詳細な分析を提供していませんが、この技術の重要性は、簡単に繊毛運動ex vivoでのあらゆる種類のスクリーニングに適用することができるシステムと費用対効果のシンプルさにあります。具体的には、TI Workbenchは、より簡単に繊毛運動を観察し、分析する研究者を可能にシンプル?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice
[header]
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2
[header]
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510