Observation du Mouvement ciliaire des cellules épithéliales plexus choroïde<em&gt; Ex Vivo</em

Résumé

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Résumé

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report¹, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Introduction

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies^2–4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus⁵ and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells⁶, and are involved in the determination of left–right asymmetry of the vertebrate body⁷.

Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia⁸. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period¹. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions⁹. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia.

With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium^5,10, motile single-cell flagella¹¹, so-called conventional motile cilia¹², and nodal cilia¹³, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed¹. Moreover, original image analysis software “TI Workbench” has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

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Protocole

Les protocoles et l'utilisation des animaux de laboratoire ont été approuvés par les soins des animaux et de l'utilisation des comités institutionnels de l'Université de Yamanashi et de l'Université de Waseda. soins aux animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles.

1. Préparation CPEC

1. Préparer des appareils et des matériaux suivants: un microscope stéréo, de préférence capable de transmettre l'illumination du fond; une paire de pinces horloger (Dumont N ° 3 ou n ° 4), la flamme stérilisé, des ciseaux d'exploitation droites, flamme stérilisé; deux plats 10 cm en plastique stériles contenant 20 ml glacée moyen Leibovitz L-15; Plats à fond de verre de 35 mm contenant 2 ml RT Leibovitz milieu L-15; un bêcher de 100 ml contenant 70% d'éthanol; souriceaux nouveau-nés.
2. Immerger brièvement une souris néonatale dans 70% d'éthanol et euthanasier rapidement par décapitation en utilisant les ciseaux d'exploitation.
3. Placez la tête immédiatement Leibovitz milieu L-15 glacée dans le stérile à 10 cm dish.
4. Retirer la peau des calvaria utilisant la paire de forceps horloger, ouvrir le crâne pour exposer le cerveau, et puis couper les nerfs crâniens pour isoler l'ensemble du cerveau.
5. Transférer le cerveau à un nouveau plat contenant Leibovitz milieu L-15 glacée et observer au microscope stéréo, faire en sorte que le cerveau est complètement immergé dans le milieu.
6. Réglez la face dorsale du cerveau vers le haut, et d'orienter le cerveau de sorte que les bulbes olfactifs résident à la position trois heures (pour les droitiers). Maintenez le cerveau en douceur avec la pince à la main gauche.
7. En utilisant les pinces à dissection fines (Dumont N ° 3 ou # 4) dans la main droite, couper le corps calleux et sous le parenchyme reliant les hémisphères cérébraux, le long de la fissure longitudinale du cerveau.
8. Poussez doucement les hémisphères cérébraux loin aux côtés latéraux et d'exposer la fissure transversale cérébrale.
9. Séparer les hémisphères par pincement sur the parenchyme entre l'hémisphère et le thalamus.
10. Tirez doucement sur le plexus choroïde ventriculaires latérales qui est attaché à la face latérale de l'hippocampe par le affixa lamina.
11. Transférer les plexus choroïde isolés au plat à fond de verre de 35 mm contenant du milieu frais Leibovitz L-15, et superposer un poids (liste des matières) doucement pour maintenir le tissu en place.

2. imagerie en direct de CPEC Cilia

1. Confirmez ultraviolet bon (UV) et le filtre (s) déduit (IR) de coupe pour bloquer la lumière inférieure à 400 nm et plus de 700 nm, et que la densité neutre (ND) filtres (25% et 6%) sont insérés dans le trajet de la lumière du microscope inversé.
2. Régler la netteté de l'objectif plus ou moins à l'oeil, et ensuite ajuster le condenseur afin que le centre et le foyer pour se conformer à l'éclairage de Köhler. Insérer un contraste interférentiel différentiel approprié (DIC) prisme, un élément DIC, ainsi que des éléments de l'analyseur et le polariseur dans le lichemin lutte pour se conformer à l'optique DIC.
3. Régler le contraste de vue par la position du prisme DIC sorte que la structure de la surface du tissu est plus reconnaissable. Si tous les cils des cellules cibles sont mobiles, une vision claire des cils mobiles ne peut pas être obtenue par l'œil en raison de leur mouvement.
4. Modifiez le chemin de lumière à la caméra vidéo, et de supprimer les filtres ND pour augmenter la puissance lumineuse.
5. Utilisez l'appareil photo en mode de mise au point de régler le champ de vision et de concentration. Au cours de mise au point, dans lequel les images vidéo sont affichées en temps réel sur l'écran, une vue claire des cils mobiles ne sont pas disponibles.
6. Utilisez l'appareil photo à 200 Hz avec un temps d'exposition de 0,1 ms pour la période souhaitée (secondes à quelques minutes). Après l'acquisition de la pile de l'image, des images uniques seront afficher structures ciliaires claires. Si bords ciliaires sont floues, d'augmenter le taux de trame ou utiliser un temps d'exposition plus courte.
7. Enregistrer le mouvement de CPEC cils au sein 25-60 minutes après l'euthanasie en LeibovitzMilieu L-15.

3. Analyse du mouvement ciliaire

1. Suivre manuellement battant motifs de chaque cil sur le moniteur de l'ordinateur. Marquer les positions de pointe ciliaire dans chaque image avec le pointeur de la souris, qui sont assemblés pour obtenir des informations trajectoire de chaque cil. Soit analyser les informations trajectoire en utilisant le même logiciel ou l'exportation vers d'autres applications plus générales pour une analyse plus approfondie. L'efficacité de cette étape d'analyse est décrite dans la discussion.
2. Classer les trajectoires en deux modes de mouvement, de va-et-vient ou de rotation, par oeil.
3. Calculer la fréquence ciliaire de battage (CBF) en utilisant la formule suivante: [CBF = (nombre d'images par seconde) / (nombre moyen d'images pour un seul battement)] ^14, qui peut être obtenu à partir d'un schéma pointe ciliaire de mouvement (Figure 3 ). Répéter ce calcul pour de multiples cycles de battement ciliaire, parce que d'autres cils sur la même cellule peut interférer avec le mouvement de chaque cilium, ce qui entraîne l'irrégularité.
4. Pour analyser l'uniformité angulaire du battement ciliaire axes dans une seule cellule, définir le θ de l'angle de battement pour chaque trajectoire (Figure 4). Pour trajectoires de va-et-vient, adapter les postes de la pointe des cils à une ligne droite, et de définir l'angle θ que la ligne fait avec axe x. Pour trajectoires de rotation, adapter les postes à une ellipse, et de définir l'angle θ que l'axe majeur de l'ellipse fait avec axe x. Détails de la ferrure sont décrits dans la section des résultats représentatifs.
5. Pour une description quantitative de chaque trajectoire, calculer généralisée rapport d'aspect AR. En bref, la trajectoire de rotation - θ et AR définir comme étant le rapport entre la largeur de la distribution le long de x - y et -axes (figure 4B). Les détails sont affichés dans la section des résultats représentatifs, et l'interprétation, L'importance et la limitation du paramètre sont décrites dans la discussion.

4. Préparation d'échantillons pour MEB

Remarque: SEM est une méthode importante pour évaluer l'état des cils sur CPEC d'une manière globale. Pour préparer des échantillons pour SEM, une procédure standard précédemment rapporté ¹⁵ est employé avec de légères modifications.

1. Avant la dissection du tissu du cerveau, préparer le fixateur dans un flacon en verre de 5 ml avec un bouchon en polyéthylène. Le fixateur est constitué de 2% de paraformaldehyde, 2,5% de glutaraldéhyde (moitié de la solution de ¹⁶ Karnovsky) dans 0,1 M de tampon phosphate, pH 7,4.
2. Disséquer les tissus du cerveau, comme décrit dans l'étape 1.
3. Rincer brièvement le tissu isolé avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) dans un nouveau plat, puis fixer le tissu dans le fixateur dans le flacon de verre pendant 1 heure à température ambiante. Utilisez pipettes de transfert unique et manipuler les spécimens gently. Après rinçage dans HBSS, le tissu devient collant.
   1. Pour transférer les échantillons dans la solution de fixateur, lentement expulser une petite quantité de solution contenant le tissu de la pipette de transfert en gouttelettes et ajouter au fixateur.
4. Après fixation, jeter le fixateur et rincer le tissu avec tampon phosphate trois fois.
5. Plonger le tissu dans une solution de saccharose à 10% pour se laver les aldéhydes restants. Pour assurer l'élimination complète des aldéhydes, plonger les échantillons dans la solution pendant 10 min, puis répéter deux fois avec des produits frais 10% de saccharose. Cette étape est importante pour parvenir à post-fixation correcte dans les étapes suivantes.
6. Plonger le tissu dans une solution de 1% de tétroxyde d'osmium dans un tampon phosphate pendant 30 min, puis placer sur la glace pour la post-fixation. Juger du degré de osmification par la couleur de l'échantillon: quand aldéhydes sont complètement enlevés, l'échantillon est noir.
7. Laver les échantillons de tissus postdéterminés abondamment avec double distilléed l'eau plusieurs fois.
8. Déshydrater les échantillons par immersion dans des concentrations échelonnées d'éthanol, généralement 65%, 75%, 85%, 95%, 99% et 100%, pendant 10 minutes chaque. Obtenir de l'éthanol anhydre en plaçant des tamis moléculaires dans 99,5% d'éthanol à partir d'une bouteille nouvellement acheté. Répétez avec déshydratation de l'éthanol anhydre à trois reprises.
9. Placer les échantillons déshydratés dans de l'acétate d'isoamyle, un réactif de substitution pour un séchage au point critique, pendant 10 min. Répéter deux fois cette étape. Ce réactif évapore rapidement et l'échantillon peut devenir sèche, provoquant la destruction par la tension de surface. Par conséquent, ne pas sécher l'échantillon complètement.
10. Après le dernier échange de l'acétate d'isoamyle, enlever la plupart du solvant, immédiatement envelopper le flacon en verre ouvert avec du papier d'aluminium et placez le flacon sur glace sèche. En utilisant une aiguille ou une pince fine, faire plusieurs trous dans la feuille de recouvrement de l'embouchure de la fiole, de telle sorte que le dioxyde de carbone liquide coule facilement dans la fiole dans le sécheur à point critique. Passez à l'étape suivanteaussi vite que possible.
11. Dans cette étape, minimiser le report de l'acétate d'isoamyle dans la chambre de la sécheuse, mais ne laissez pas l'échantillon sécher complètement avant séchage au point critique. En outre, ne pas laisser l'échantillon sur de la glace sèche pour une inutilement beaucoup de temps pour éviter la formation de givre sur le flacon.
12. Transférer les flacons de verre papillote contenant les échantillons de tissus dans le sèche-linge au point critique qui assure la structure de la surface du tissu reste intact tandis que l'eau contenue dans l'élimination du tissu. Des informations détaillées sur le fonctionnement du sèche point critique peut être obtenu à partir des instructions du fabricant.
13. Manipulez les échantillons soigneusement à l'aide d'un cure-dent pour minimiser les dommages mécaniques. Les échantillons de tissus séchées résultantes sont fragiles. Montez les échantillons sur les moignons métalliques et manteau avec de l'or-palladium en utilisant une pulvérisation d'ions.

5. observation par MEB

1. Observez par SEM et enregistrer des images avec un appareil photo numériqueéquipé d'un microscope électronique à balayage.
2. Transférer des données d'image numériques à un ordinateur pour analyse.

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Résultats

Vue d'ensemble du flux de production est représenté sur la Figure 1, y compris les images des dispositifs.

Observations de mouvement direct de CPEC

Film 1 montre un film de CPEC isolés à partir d'une souris périnatale et Movie 2 montre une vue agrandie des images dans le film 1. Il convient de noter que des conseils individuels ciliaires sont moins claires dans les images fixes par r...

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Discussion

Perspectives de cette méthode

Bien que la technique décrite ici ne prévoit pas une analyse plus détaillée des cils que les méthodes déjà publiées, la signification de cette technique réside dans la simplicité du système et l'efficacité des coûts, qui peut être facilement appliquée au dépistage tout type de motilité ciliaire ex vivo. En particulier, TI Workbench fournit une interface simple et conviviale qui permet aux chercheurs d'observer et d'analyser...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice
[header]
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2
[header]
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510