Наблюдение за Мерцательная Движения сосудистое сплетение эпителиальных клеток<em&gt; Экс Vivo</em

Резюме

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Аннотация

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report¹, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Введение

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies^2–4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus⁵ and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells⁶, and are involved in the determination of left–right asymmetry of the vertebrate body⁷.

Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia⁸. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period¹. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions⁹. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia.

With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium^5,10, motile single-cell flagella¹¹, so-called conventional motile cilia¹², and nodal cilia¹³, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed¹. Moreover, original image analysis software “TI Workbench” has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Протоколы и использование экспериментальных животных были одобрены институциональных уходу за животными и использование комитетов в университете Яманаси и университета Васэда. Уход за животными проводили в соответствии с ведомственным руководящим принципам.

1. Подготовка КЗЭК

1. Подготовьте следующие устройства и материалы: Стерео микроскоп, предпочтительно, способный передавать освещение снизу; пара щипцов часовщик (Дюмон # 3 или # 4), пламя стерилизовать, прямые операционные ножницы, пламя стерилизовать; два стерильных 10 см пластиковой посуды, содержащие 20 мл ледяной Лейбовиц L-15 среды; 35 мм со стеклянным дном блюда, содержащие 2 мл РТ Лейбовиц L-15 среды; 100 мл химический стакан, содержащий 70% этанола; неонатальные щенки мыши.
2. Кратко погрузить новорожденных мышь в 70% этанола и быстро усыпить путем обезглавливания с помощью операционной ножницы.
3. Сразу же место голову в ледяной Лейбовиц L-15 среды, в стерильной 10 см дишиллинг
4. Снимите кожу с использованием свода черепа пару щипцов часовщика, разрезать череп подвергать мозг, а затем разрезать черепные нервы, чтобы изолировать весь мозг.
5. Перевести мозг в новое блюдо, содержащей ледяной Лейбовиц L-15 среды и наблюдать под микроскопом стерео, убедившись, что мозг полностью погружен в среду.
6. Установите спинной мозг вверх и ориентировать мозг таким образом, что обонятельные луковицы находятся в положении 3:00 (для правшей). Держите мозг осторожно пинцетом в левой руке.
7. Использование тонких щипцов (рассечение Дюмон # 3 или # 4) в правой руке, отрезать мозолистого тела и под паренхимы, соединяющий полушария, вдоль продольной трещины головного мозга.
8. Аккуратно нажмите полушарий от боковым сторонам и подвергать поперечной мозговой трещину.
9. Отделите полушария, зажимая из йе паренхимы между полушарии и таламуса.
10. Аккуратно вытащить боковые сосудистое сплетение желудочков, которая крепится к боковой стороне гиппокампа по пластинке affixa.
11. Перевести выделенные сосудистое сплетение в 35 мм со стеклянным дном блюдо с свежей Лейбовиц L-15 среды, и накладывать массу (список материалов) мягко, чтобы держать ткань в месте.

2. Живая съемка КЗЭК Cilia

1. Подтвердите правильное ультрафиолет (УФ) и вывод (ИК) фильтр отсечки (ы), чтобы заблокировать свет короче 400 нм и длиннее 700 нм, и что нейтральный плотности (ND) фильтры (25% и 6%) вставляются в пути света из инвертированного микроскопа.
2. Настройте фокус объектива примерно на глаз, а затем настроить конденсатор, так что центр и фокус, чтобы соответствовать освещения Келера. Вставьте соответствующий дифференциального интерференционного контраста (ДИК) призмы, DIC элементом, а также анализатора и поляризатора элементов в LiGHT путь, чтобы соответствовать оптики DIC.
3. Регулировка контрастности зрения положением DIC призмы так, чтобы структура поверхности ткани является самым узнаваемым. Если все реснички клеток-мишеней подвижны, четкое представление о подвижных ресничек не может быть получена на глаз из-за их движением.
4. Измените путь света к видеокамере, и удалить нейтральные фильтры, чтобы увеличить световой мощности.
5. Используйте камеру в режим фокусировки, чтобы отрегулировать поле зрения и внимания. Во время фокусировки, в которой видео изображения отображаются в режиме реального времени на мониторе, очевидно, вид подвижных ресничек не доступен.
6. Используйте камеру на 200 Гц при времени экспозиции 0,1 мс для требуемого периода (от секунд до минут). После приобретения пакета изображений, отдельные кадры будут отображаться четкие цилиарных структур. Если цилиарные края размыты, увеличить частоту кадров или использовать более короткое время экспозиции.
7. Запишите движение ресничек КЗЭК в 25-60 мин после эвтаназии в ЛейбовицL-15 среднего.

3. Анализ движения Мерцательная

1. Вручную отслеживать избиении модели каждого реснички на мониторе компьютера. Все позиции мерцательная наконечник в каждом кадре с указателем мыши, которые собраны для траекторной информации каждого реснички. Либо проанализировать траекторию информацию, используя то же программное обеспечение или экспорт в другие, более общего применения для дальнейшего анализа. Эффективность этого шага анализа описан в дискуссии.
2. Оцените траектории в двух режимах движения, возвратно-поступательный или вращательный, на глазок.
3. Вычислить частоту биений цилиарного (CBF) с помощью следующей формулы: [CBF = (количество кадров в секунду) / (среднее число кадров для одного такт)] ^14, которые могут быть получены из диаграммы движения цилиарного наконечник (фиг.3 ). Повторите этот расчет для нескольких циклов мерцательная избиение, потому что другие, реснички на той же клетке могут мешать движению каждого ciliuм, в результате неравномерности.
4. Для анализа угловой однородность цилиарной избиение осей в пределах одной ячейки, определить угол θ избиение для каждой траектории (рис 4). Для назад и вперед траекторий, соответствовать позиции кончика реснички к прямой линии, и определить θ как угол линии делает с оси х. Для вращающихся траекторий, соответствовать позиции к эллипсу, и определить θ как угол большой оси эллипса составляет с оси х. Подробная информация о фитинга описаны в разделе Результаты представитель.
5. Для количественного описания каждой траектории, рассчитать обобщенную пропорции AR. Вкратце, повернуть траекторию - θ и определяют AR как отношение между шириной распределения по х - и у -axes (рис 4б). Подробности приведены в разделе Результаты Представительства и интерпретация, Значимость, и ограничение параметра описаны в дискуссии.

4. Подготовка проб для SEM

Примечание: СЭМ является важным методом для оценки состояния ресничек на CPECs в полном объеме. Для подготовки образцов для РЭМ, стандартная процедура сообщалось ранее ¹⁵ используется с небольшими изменениями.

1. Перед рассмотрением ткани из мозга, подготовить фиксатор в стеклянный флакон 5 мл с полиэтиленовой крышкой. Фиксатор состоит из 2% параформальдегида, 2,5% глутарового альдегида (половина раствора Карновского в ¹⁶⁾ в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4.
2. Рассеките из ткани из мозга, как описано в шаге 1.
3. Кратко промыть изолированную ткань с сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) в новое блюдо, а затем зафиксировать ткани в фиксаторе в стеклянной пробирке в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте одноразовые пипетки передачи и обработки образцов Gently. После промывки в HBSS, ткань становится липким.
   1. Для передачи образцов в растворе фиксирующего медленно изгнать небольшое количество раствора, содержащего ткань из пипетки в капли и добавить к фиксатором.
4. После фиксации отказаться от фиксатора и промойте ткань с фосфатным буфером три раза.
5. Погружают ткань в 10% растворе сахарозы промыть остальные альдегиды. Чтобы обеспечить полное удаление альдегидов, погрузить образцы в растворе в течение 10 мин, а затем повторить два раза со свежим 10% сахарозы. Это важно для достижения надлежащего пост-фиксацию на последующих стадиях.
6. Погружают ткань в раствор 1% осмия в фосфатном буфере в течение 30 мин, а затем поместить на льду в течение после фиксации. Судить о степени osmification по цвету образца: когда альдегиды полностью удалены, образец черного цвета.
7. Вымойте образцы фиксировали ткани широко с двойным дистиллированнойd воды несколько раз.
8. Обезвоживают образцы погружением в переменной концентрации этанола, как правило, 65%, 75%, 85%, 95%, 99% и 100%, в течение 10 мин каждый. Получить безводного этанола путем размещения молекулярных сит в 99,5% этанола из недавно купленного бутылку. Повторите обезвоживание безводным этанолом три раза.
9. Поместите обезвоженные образцы в изоамилацетат, замещения реагента для сушка в критической точке, в течение 10 мин. Повторите этот шаг дважды. Этот реагент быстро испаряется, и образец может стать сухой, что приводит к разрушению поверхностным натяжением. Таким образом, не сушить образец полностью.
10. После окончательного обмена изоамилацетат, удалить большую часть растворителя, немедленно обернуть открытую стеклянную ампулу с алюминиевой фольгой, и поместить флакон на сухом льду. С помощью иглы или тонкий пинцет, сделать несколько отверстий в фольге, покрывающей рот флакона, так что жидкий диоксид углерода протекает легко в флаконе в критической точке сушилку. Перейдите к следующему шагукак можно быстрее.
11. На этом этапе, свести к минимуму вынос изоамилацетат в камеру сушилки, но не позволяйте образец полностью высохнуть, прежде чем сушка в критической точке. Кроме того, не оставляйте пробы на сухом льду для излишне долго, чтобы избежать обмерзания на флаконе.
12. Передача стеклянные флаконы обернутого фольгой, содержащие образцы ткани в критической точке сушилку, который обеспечивает поверхностную структуру ткани остается неизменным во время удаления воды, содержащейся в ткани. Подробная информация о работе с критическую точку сушилка может быть получена из инструкций изготовителя.
13. Ручка образцы тщательно используя зубочистку, чтобы свести к минимуму механическое повреждение. Полученные высушенные образцы тканей являются хрупкими. Установите образцы на металлических заглушек и пальто с золотой палладия с использованием ионного НАПЫЛЕНИЕМ.

5. Наблюдение с помощью СЭМ

1. Соблюдайте СЭМ и записывать изображения с цифровой камерыоборудованы сканирующего электронного микроскопа.
2. Передачи данных цифрового изображения на ПК для анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Обзор рабочего процесса показан на рисунке 1, в том числе изображения устройств.

Текущие наблюдения движения CPECs

Фильм 1 показан фильм CPECs, выделенных из мыши перинатальной и фильм 2 показан увеличенный вид изображений в кин?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Перспективы этого метода

Хотя способ, описанный здесь, не обеспечивает более точный анализ ресничек, чем ранее опубликованных методов, значение этого метода состоит в простоте системы и экономической эффективности, которые могут быть с легкостью применить для скринин?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice
[header]
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2
[header]
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510