Beobachtung der Flimmerbewegung von Plexus Epithelzellen<em&gt; Ex Vivo</em

Zusammenfassung

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Zusammenfassung

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report¹, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Einleitung

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies^2–4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus⁵ and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells⁶, and are involved in the determination of left–right asymmetry of the vertebrate body⁷.

Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia⁸. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period¹. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions⁹. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia.

With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium^5,10, motile single-cell flagella¹¹, so-called conventional motile cilia¹², and nodal cilia¹³, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed¹. Moreover, original image analysis software “TI Workbench” has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

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Protokoll

Die Protokolle und die Verwendung von Versuchstieren wurden von den institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschüsse an der University of Yamanashi und Waseda University zugelassen. Tierpflege wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. CPEC Vorbereitung

1. Bereiten Sie die folgenden Vorrichtungen und Materialien: ein Stereo-Mikroskop, vorzugsweise geeignet zur Übertragung von Beleuchtung von unten; ein Paar von Uhrmacher Pinzette (Dumont # 3 oder # 4), flammsterilisiert, gerade Betriebs Schere, flamm sterilisiert; zwei sterile 10 cm Plastikschalen mit 20 ml eiskaltem Leibovitz L-15-Medium; 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml RT Leibovitz L-15-Medium; ein 100 ml Becherglas, das 70% Ethanol; neonatalen Maus Welpen.
2. Kurz eintauchen eine neonatale Maus in 70% Ethanol und schnell einschläfern durch Enthauptung mit dem Betriebs Schere.
3. Platzieren Sie den Kopf sofort in eiskaltem Leibovitz L-15-Medium in das sterile 10 cm dish.
4. Entfernen Sie die Haut von den Schädeldecke mit Hilfe der beiden Uhrmacher Zangen, schnitt den Schädel, um das Gehirn freizulegen, und dann schneiden Sie die Hirnnerven, die ganze Gehirn zu isolieren.
5. Übertragen Sie das Gehirn zu einem neuen Schale mit eiskaltem Leibovitz L-15-Medium und beobachten unter dem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass das Gehirn vollständig in das Medium eingetaucht.
6. Stellen Sie die Dorsalseite des Gehirns nach oben ein, und richten Sie das Gehirn, so dass die Riechkolben wohnen an der Drei-Uhr-Position (für Rechtshänder). Halten Sie das Gehirn vorsichtig mit der Pinzette in die linke Hand.
7. Mit den feinen Pinzette Dissektion (Dumont # 3 oder # 4) in der rechten Hand, schneiden Sie den Balken und unterhalb des Parenchyms Verbinden der Gehirnhälften, die entlang der Längsspalte des Großhirns.
8. Schieben Sie die Gehirnhälften entfernt an den Seiten und setzen die Querhirnspalte.
9. Trennen Sie die Hemisphären durch Kneifen out the Parenchym zwischen der Hemisphäre und Thalamus.
10. Ziehen Sie vorsichtig die seitlichen Ventrikel Plexus, die auf der lateralen Seite des Hippocampus durch die Lamina affixa angebracht ist.
11. Übertragen Sie die isolierten Plexus auf die 35 mm Glasbodenschale mit frischen Leibovitz L-15-Medium, und überlagern ein Gewicht (Materialliste) leicht, um das Gewebe in Position zu halten.

2. Live-Imaging von CPEC Cilia

1. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße ultraviolette (UV) und geschlossen (IR) Cut-Filter (n) zu sperren Licht kürzer als 400 nm und länger als 700 nm, und das Neutraldichtefilter (ND) (25% bzw. 6%) in den Strahlengang eingelegt des invertierten Mikroskops.
2. Stellen Sie den Fokus des Objektivs grob durch Auge und stellen Sie dann den Kondensator, so dass das Zentrum und Fokus auf die Köhler-Beleuchtung entsprechen. Legen Sie eine geeignete Differentialinterferenzkontrast (DIC) Prisma, ein DIC-Element sowie Analysator und Polarisator Elemente in der liGHT PATH um das DIC Optik entsprechen.
3. Stellen Sie den Kontrast der Blick von der DIC-Prisma Position, so dass die Struktur der Gewebeoberfläche ist besonders erkennbar. Wenn alle Zilien der Zielzellen sind beweglich, eine klare Sicht auf bewegliche Zilien kann nicht mit dem Auge wegen ihrer Bewegung erreicht werden.
4. Ändern Sie den Lichtweg zu der Videokamera und der ND-Filter zu entfernen, um die Lichtleistung zu erhöhen.
5. Verwenden Sie die Kamera in Fokusmodus, um das Sichtfeld und Fokus einzustellen. Während der Fokussierung, bei der Videobilder in Echtzeit auf dem Monitor angezeigt wird, ist eine klare Sicht auf bewegliche Zilien nicht verfügbar.
6. Mit der Kamera bei 200 Hz mit einer Belichtungszeit von 0,1 ms für den gewünschten Zeitraum (Sekunden bis Minuten). Nach der Übernahme des Bildstapels wird Einzelbilder klar ciliary Strukturen anzuzeigen. Wenn ciliary Kanten sind unscharf, erhöht die Bildrate oder verwenden Sie eine kürzere Belichtungszeit.
7. Nehmen Sie die Bewegung der Flimmerhärchen CPEC innerhalb 25-60 Minuten nach der Euthanasie in LeibovitzL-15-Medium.

3. Analyse der Flimmerbewegung

1. Manuell verfolgen schlagen Muster jedes cilium auf dem Computermonitor. Filter ciliary Spitzenpositionen in jedem Rahmen mit dem Mauszeiger, die Flugbahn-Informationen jedes cilium zusammengesetzt werden. Entweder analysieren die Flugbahn Daten mit der gleichen Software oder den Export in andere allgemeinere Anwendungen für die weitere Analyse. Die Effizienz dieses Analyseschritt auch in der Diskussion beschrieben.
2. Klassifizierung der Bahnen in zwei Bewegungsarten, hin- und her bzw. Dreh, mit dem Auge.
3. Berechnen Sie die Zilienschlag Frequenz (CBF) mit der folgenden Formel: [CBF = (Anzahl der Bilder pro Sekunde) / (durchschnittliche Anzahl der Bilder für einen einzelnen Schlag)] ^14, die aus einer ciliary Spitze Bewegungsdiagramm erhalten werden können (Abbildung 3 ). Wiederhole diese Berechnung für mehrere Zilienschlag Zyklen, weil andere Zilien auf der gleichen Zelle kann mit der Bewegung jedes ciliu interferierenm, was zu Unregelmäßigkeiten.
4. Um die Winkel Gleichmäßigkeit der Zilienschlag Achsen innerhalb einer einzelnen Zelle zu analysieren, definieren das Schlagen Winkel θ für jede Flugbahn (Abbildung 4). Für Hin-und-her-Trajektorien, passen die Positionen der Zilien Spitze auf eine gerade Linie, und definieren θ als Winkel der Linie macht mit x-Achse. Für Dreh Trajektorien, passen die Positionen zu einer Ellipse und definieren θ als Winkel der Hauptachse der Ellipse macht mit x-Achse. Details der Armatur sind im Repräsentative Ergebnisse beschrieben.
5. Zur quantitativen Beschreibung der einzelnen Flugbahn berechnen verallgemeinerte Seitenverhältnis AR. Kurz gesagt, dreht die Trajektorie durch - θ und AR definieren als das Verhältnis zwischen der Breite der Verteilung entlang x - und y-Achsen (4B). Einzelheiten sind in der Repräsentative Ergebnisse Schnitt gezeigt, und die Interpretation, Bedeutung, und die Begrenzung der Parameter sind in der Diskussion beschrieben.

4. Probenvorbereitung für die SEM

Anmerkung: SEM ist ein wichtiges Verfahren, um den Status der Zilien auf CPECs in umfassender Weise auszuwerten. Um Proben für SEM vorzubereiten, berichtete ein Standardverfahren zuvor ¹⁵ mit geringen Modifikationen verwendet.

1. Vor der Zerlegung der Gewebe aus dem Gehirn, bereiten Sie die Fixiermittel in einer 5 ml-Glasgefäß mit einer Polyethylenkappe. Das Fixiermittel besteht aus 2% Paraformaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd (Halb Karnovsky-Lösung ¹⁶⁾ in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4.
2. Präparieren Sie das Gewebe aus dem Gehirn, wie in Schritt 1 beschrieben.
3. Kurz abspülen isolierten Gewebes mit ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) in ein neues Gericht und dann fix das Gewebe in der Fixiermittel in dem Glasfläschchen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Verwenden Sie Einweg-Transferpipetten und behandeln die Proben gently. Nach Spülen in HBSS, wird das Gewebe klebrig.
   1. Um die Proben in die Fixierungslösung zu übertragen, zu vertreiben langsam eine kleine Menge der Lösung, die das Gewebe von der Transferpipette als ein Tröpfchen und zu dem Fixiermittel.
4. Nach der Fixierung, entsorgen Sie die Fixierungsmittel und spülen Sie das Gewebe mit Phosphatpuffer dreimal.
5. Tauchen Sie das Gewebe in einer 10% igen Saccharoselösung zum Auswaschen der verbleibenden Aldehyde. Um vollständige Beseitigung von Aldehyden zu gewährleisten, tauchen Sie die Proben in der Lösung für 10 Minuten und wiederholen Sie dann zweimal mit frischem 10% Saccharose. Dieser Schritt ist wichtig, die richtige Postfixierung in den nachfolgenden Schritten zu erreichen.
6. Tauchen des Gewebes in einer Lösung von 1% Osmiumtetroxid in Phosphatpuffer für 30 min und dann auf Eis für Postfixierung. Beurteilen Sie den Grad der osmification von der Probe Farbe: wenn Aldehyde vollständig entfernt ist die Probe schwarz.
7. Die post-fixierten Gewebeproben umfassend Waschen mit Doppel destilliertd Wasser mehrmals.
8. Dehydratisieren die Proben durch Eintauchen in abgestufte Konzentrationen von Ethanol, in der Regel 65%, 75%, 85%, 95%, 99% und 100%, für jeweils 10 min. Erhalten wasserfreiem Ethanol, indem Molekularsiebe in 99,5% Ethanol aus einer neu gekauften Flasche. Wiederholen Dehydratisierung mit wasserfreiem Ethanol dreimal.
9. Legen Sie die dehydrierten Proben in Isoamylacetat, einem Substitutions Reagenz zum Trocknen am kritischen Punkt, für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Dieses Reagenz schnell verdampft und die Probe kann trocken werden, was zu einer Zerstörung durch die Oberflächenspannung. Daher nicht die Probe vollständig trocknen.
10. Nach dem letzten Austausch von Isoamylacetat, entfernen Sie das meiste Lösungsmittel, sofort wickeln Sie das offene Glas mit Aluminiumfolie, und legen Sie das Fläschchen auf Trockeneis. Mittels einer Nadel oder einer feinen Pinzette, stellen mehrere Löcher in die Folie für den Mund des Fläschchens, so daß flüssiges Kohlendioxid fließt leicht in die Phiole in dem kritischen Punkt Trockner. Fahren Sie mit dem nächsten Schrittso schnell wie möglich.
11. In diesem Schritt minimieren die Übertragung von Isoamylacetat in die Kammer des Trockners, aber lassen Sie die Probe vollständig austrocknen, bevor Trocknen am kritischen Punkt. Hinzu kommt, dass die Probe nicht auf Trockeneis verlassen unnötig lange Zeit, um die Bildung von Frost auf dem Fläschchen zu vermeiden.
12. Übertragen Sie die Folie eingeGlasFläschchen, die die Gewebeproben in den kritischen Punkt Trockner, dass die Oberflächenstruktur des Gewebes bleibt erhalten, während das Wasser im Gewebe enthaltenen gewährleistet. Detaillierte Informationen über den Betrieb der kritischen Punkt Trockner können aus den Anweisungen des Herstellers bezogen werden.
13. Behandeln Sie die Proben vorsichtig mit einem Zahnstocher, um mechanische Schäden zu minimieren. Das resultierende getrocknete Gewebeproben sind zerbrechlich. Montieren Sie die Proben auf Metall Stubs und Mantel mit Gold-Palladium unter Verwendung eines Ionen Sputter.

5. Beobachtung durch SEM

1. Beobachten von SEM und Bilder aufnehmen mit einer Digitalkamerazu Rasterelektronenmikroskop ausgestattet.
2. Übertragen digitaler Bilddaten auf einen PC zur Auswertung.

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Ergebnisse

Ein Überblick über den Arbeitsablauf ist in Figur 1 dargestellt ist, einschließlich der Bilder der Geräte.

Live Motion Beobachtungen CPECs

Film 1 zeigt ein Film von CPECs aus einer perinatalen Maus isoliert und Movie 2 zeigt eine vergrößerte Ansicht der Bilder in Film 1. Es wird darauf hingewiesen, dass einzelne ciliary Tipps sind in Vergleich mit denen in Filmen Einzelbilder weniger klar w...

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Diskussion

Perspektiven dieser Methode

Obwohl die hier beschriebene Technik ist eine detailliertere Analyse der Zilien als bisher veröffentlichten Verfahren liefern, die Bedeutung dieser Technik besteht in der Einfachheit des Systems und Kosteneffizienz, die leicht an jede Art von Screening Zilienmotilitätsstörungen ex vivo angewendet werden kann. Insbesondere stellt TI Workbench eine einfache und benutzerfreundliche Schnittstelle, die Forschern die Beobachtung und leichter analysieren Zili...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice
[header]
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2
[header]
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510