Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide<em&gt; Ex Vivo</em

Resumo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Resumo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report¹, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Introdução

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies^2–4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus⁵ and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells⁶, and are involved in the determination of left–right asymmetry of the vertebrate body⁷.

Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia⁸. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period¹. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions⁹. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia.

With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium^5,10, motile single-cell flagella¹¹, so-called conventional motile cilia¹², and nodal cilia¹³, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed¹. Moreover, original image analysis software “TI Workbench” has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

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Protocolo

Os protocolos e uso de animais de laboratório foram aprovados pelos cuidados com os animais e uso comitês institucionais da Universidade de Yamanashi e Universidade de Waseda. Cuidados com os animais foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais.

1. Preparação CPEC

1. Preparar os seguintes aparelhos e materiais: um microscópio estéreo, de um modo preferido capaz de transmitir luz a partir do fundo; um par de fórceps Dumont relojoeiro (# 3 ou # 4), esterilizada por chama, tesouras operacionais em linha reta, esterilizada por chama; dois pratos de 10 centímetros de plástico estéreis contendo 20 ml de gelo-frio Leibovitz L-15 de forma; Pratos com fundo de vidro 35 milímetros contendo 2 ml RT Leibovitz meio L-15; Num copo de 100 ml contendo 70% de etanol; filhotes de rato recém-nascidos.
2. Resumidamente mergulhe um rato neonatal em 70% de etanol e eutanásia rapidamente por decapitação usando a tesoura operacionais.
3. Coloque a cabeça imediatamente em gelo frio Leibovitz L-15, na forma estéril 10 centímetros dish.
4. Remover a pele dos calvária usando o par de pinças de relojoeiro, abriu o crânio para expor o cérebro, e depois cortar os nervos cranianos para isolar todo o cérebro.
5. Transferir o cérebro para uma nova placa contendo gelada Leibovitz L-15 médio e observar ao microscópio estéreo, certificando-se que o cérebro está completamente imerso no meio.
6. Defina o aspecto dorsal do cérebro voltado para cima, e orientar o cérebro para que os bulbos olfatórios residir na posição de três horas (para pessoas destras). Segure o cérebro suavemente com a pinça na mão esquerda.
7. Usando a pinça de dissecação fina (Dumont # 3 ou # 4) na mão direita, corte do corpo caloso e debaixo do parênquima conectando os hemisférios cerebrais, ao longo da fissura longitudinal do cérebro.
8. Com cuidado, empurre os hemisférios cerebrais longe para os lados laterais e expor a fissura transversa do cérebro.
9. Separe os hemisférios por beliscar fora the parênquima entre o hemisfério e tálamo.
10. Retire cuidadosamente o plexo coróide ventriculares laterais que é anexado para o lado lateral do hipocampo pelo Affixa lâmina.
11. Transferir o plexo coróide isoladas para o prato fundo de vidro 35 milímetros contendo fresco Leibovitz meio L-15, e sobrepor o peso máximo (Lista de Materiais) com cuidado para segurar o tecido no lugar.

2. Imagens ao vivo da CPEC Cilia

1. Confirmar ultravioleta adequada (UV) e filtro (s) inferida (IR) de corte para bloquear luz inferior a 400 nm e acima de 700 nm, e que a densidade neutro (ND) os filtros (25% e 6%), são inseridos no caminho da luz do microscópio invertido.
2. Ajuste o foco da lente objetiva aproximadamente por olho, e então ajustar o condensador de modo que o centro e foco para estar de acordo com a iluminação Köhler. Inserir um contraste de interferência diferencial adequado (DIC) prisma, um elemento DIC, bem como elementos do analisador e polarizador na licaminho lutar para estar de acordo com a ótica DIC.
3. Ajustar o contraste de vista pela posição do prisma DIC modo que a estrutura da superfície do tecido é mais reconhecível. Se todos os cílios das células alvo são móveis, uma visão clara dos cílios móveis não podem ser obtidos por olho por causa do seu movimento.
4. Altere o caminho de luz para a câmera de vídeo e remova os filtros ND para aumentar o poder de luz.
5. Use a câmera no modo de focagem para ajustar o campo de visão e foco. Durante focagem, em que as imagens de vídeo são exibidas em tempo real no monitor, uma visão clara dos cílios móveis não está disponível.
6. Use a câmera em 200 Hz com um tempo de exposição de 0,1 ms para o período desejado (segundos a minutos). Após a aquisição da pilha de imagens, quadros únicos irá exibir estruturas ciliares claras. Se bordas ciliares são borradas, aumentar a taxa de quadros ou use um tempo de exposição mais curto.
7. Grave o movimento de CPEC cílios dentro de 25-60 minutos após a eutanásia em LeibovitzMeio L-15.

3. Análise do Movimento ciliar

1. Controlar manualmente batendo padrões de cada cílio no monitor do computador. Marcar posições de ponta ciliar em cada quadro com o ponteiro do mouse, que são montados para informação trajetória de cada cílio. Ou analisar a informação trajetória utilizando o mesmo software ou exportar para outras aplicações mais gerais para uma análise mais aprofundada. A eficiência deste passo de análise é descrito na discussão.
2. Classifique as trajetórias em dois modos de movimento, volta-e-vem de rotação, ou por olho.
3. Calcula-se a frequência de batimento ciliar (CBF), utilizando a seguinte fórmula: [CBF = (número de quadros por segundo) / (número médio de imagens para um único batimento)] ^14, que pode ser obtido a partir de um diagrama de ponta movimento ciliar (Figura 3 ). Repetir este cálculo para múltiplos ciclos de batimento ciliar, porque outra cílios na mesma célula pode interferir com o movimento de cada cilium, resultando em irregularidade.
4. Para analisar a uniformidade angular do batimento ciliar eixos dentro de uma única célula, definem o ângulo θ batida para cada trajectória (Figura 4). Para trajetórias de vai-e-vem, se encaixam as posições da ponta dos cílios para uma linha reta, e definir θ como o ângulo da linha faz com eixo x. Para trajectórias de rotação, encaixam as posições de uma elipse, e definir θ como o ângulo do eixo maior da elipse faz com eixo x. Detalhes da instalação são descritos na secção de resultados representativos.
5. Para obter uma descrição quantitativa de cada trajetória, calcular generalizada proporção AR. Resumidamente, rodar a trajectória por - θ e definir AR como a relação entre as larguras da distribuição ao longo - x e y -axes (Figura 4B). Detalhes são mostrados na seção Resultados Representante, ea interpretação, Significado ea limitação do parâmetro são descritos na discussão.

4. Preparação de Amostras para SEM

Nota: SEM é um importante método para avaliar o estado dos cílios em CPECs de uma forma abrangente. Para preparar as amostras para SEM, um procedimento padrão reportada anteriormente ¹⁵ é empregue com ligeiras modificações.

1. Antes de dissecação do tecido a partir do cérebro, preparar o fixador em um frasco de vidro de 5 ml com uma tampa de polietileno. O fixador é constituído por 2% de paraformaldeído, glutaraldeído a 2,5% (metade da solução de Karnovsky ¹⁶⁾ em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4.
2. Dissecar o tecido do cérebro, tal como descrito no passo 1.
3. Resumidamente enxaguar o tecido isolado com solução salina equilibrada de Hank (HBSS) numa nova placa e, em seguida, fixar o tecido no fixador no frasco de vidro, durante 1 h à temperatura ambiente. Use pipetas de transferência descartáveis ​​e manipular os espécimes gently. Depois de enxaguar em HBSS, o tecido torna-se pegajosa.
   1. Para transferir as amostras para a solução fixadora, lentamente expulsar uma pequena quantidade de solução que continha o tecido a partir da pipeta de transferência como uma gota e adicionar ao fixador.
4. Após a fixação, descartar o fixador e lavar o tecido com tampão fosfato de três vezes.
5. Mergulha-se o tecido numa solução de sacarose a 10% para lavar os aldeídos restantes. Para assegurar a eliminação total de aldeídos, imergir as amostras na solução durante 10 min e, em seguida, repetir duas vezes com sacarose a 10% fresco. Este passo é importante para garantir a boa pós-fixação em etapas subseqüentes.
6. Mergulha-se o tecido numa solução de 1% de tetróxido de ósmio em tampão de fosfato durante 30 min e, em seguida, colocar em gelo para pós-fixação. Julgar o grau de osmification pela cor da amostra: quando os aldeídos são completamente removidas, a amostra é preto.
7. Lave as amostras pós-fixadas de tecido extensivamente com duplo Distilled água várias vezes.
8. Desidratar as amostras por imersão em concentrações graduadas de etanol, geralmente 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, e 100%, durante 10 min cada. Obtenção de etanol anidro, colocando peneiras moleculares em etanol 99,5% de uma garrafa recém-adquirido. Repita desidratação com etanol anidro três vezes.
9. Coloque as amostras desidratadas em acetato de isoamilo, um reagente para a substituição ponto crítico de secagem, durante 10 min. Repita esta etapa duas vezes. Este reagente e evapora-se rapidamente a amostra pode tornar-se seca, resultando na destruição pela tensão superficial. Portanto, não secar a amostra completamente.
10. Após a última troca de acetato de isoamilo, remover a maior parte do solvente, imediatamente embrulhar o frasco de vidro aberta com uma folha de alumínio e coloque o frasco em gelo seco. Utilizando uma agulha ou uma pinça fina, fazer vários orifícios na folha que cobre a boca do frasco, de modo que o dióxido de carbono líquido flui facilmente para dentro do frasco no secador de ponto crítico. Prossiga para a próxima etapao mais rápido possível.
11. Nesta etapa, minimizar a transição de acetato de isoamilo na câmara do secador, mas não deixe que a amostra secar completamente antes de secar ponto crítico. Além disso, não deixe a amostra em gelo seco para um desnecessariamente muito tempo para evitar a formação de geada no frasco.
12. Transferir os frascos de vidro envolto com folha de alumínio contendo as amostras de tecido em secador de ponto crítico a que assegura a estrutura da superfície do tecido permanece intacta, enquanto a remoção da água contida no tecido. Informações pormenorizadas sobre a operação do secador de ponto crítico pode ser obtido a partir de instruções do fabricante.
13. Lidar com as amostras cuidadosamente usando um palito para minimizar danos mecânicos. As amostras de tecidos secos resultantes são frágeis. Monte as amostras em bases metálicas e revestimento com ouro-paládio usando uma pulverização catódica de íons.

5. Observação por SEM

1. Observe por SEM e gravar imagens com uma câmera digitalequipado com microscópio eletrônico de varredura.
2. Transferir os dados de imagem digitais para um PC para análise.

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Resultados

Uma visão geral do fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1, incluindo imagens dos dispositivos.

Observações de movimento ao vivo de CPECs

Filme 1 mostra um filme de CPECs isoladas de um rato perinatal, e Filme 2 mostra uma visão expandida das imagens em filme 1. Deve-se notar que as pontas ciliares individuais são menos claras nas imagens fixas comparados com os dos filmes. A Figur...

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Discussão

Perspectivas deste método

Embora a técnica aqui descrita não proporciona uma análise mais detalhada dos cílios do que os métodos previamente publicados, o significado desta técnica reside na simplicidade do sistema e relação custo-eficácia, que pode ser facilmente aplicado a qualquer tipo de rastreio de motilidade ciliar ex vivo. Em particular, TI Workbench fornece uma interface simples e fácil de usar que permite aos pesquisadores observar e analisar a motilidade ciliar ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice
[header]
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2
[header]
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510