Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Abstract

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Introduction

في المختبر ثنائية الأبعاد (2D) الشبكات العصبية بالإضافة إلى مايكرو الكهربائي صالحة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) arethe نموذج تجريبي الذهب القياسية المعتمدة لدراسة التفاعل بين الديناميات العصبية والربط الأساسي. خلال تطوير وإعادة الخلايا العصبية الشبكات المعقدة التي تعرض جيدا definedspatio-temporalpatternsof النشاط 1،2 (أي رشقات نارية، رشقات نارية الشبكة، والنشاط ارتفاعه عشوائي). الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسجل النشاط الكهربية من العديد من المواقع (من عشرات الآلاف من الميكروية)، والسماح لتحقيق مفصل لديناميات أعرب على مستوى الشبكة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الثقافات فصلها يجعل المحتملة التي لتصميم الشبكات الهندسية. فمن الأسهل للفهم بهذه الطريقة العلاقات الوظيفية بين النشاط الكهربية تسجيلها والمعلمات من تنظيم الشبكة مثل كثافة الخلية 3، ودرجة نمطية 4،5، وجود غير متجانسة البوب ​​العصبيةulations 6، وما إلى ذلك، تقوم كل الدراسات في المختبر على خلايا المستزرعة نأت على 2D الشبكات العصبية. هذا النهج يؤدي إلى التبسيط فيما يتعلق (في جوهرها 3-الأبعاد، 3D) نظام في الجسم الحي: (ط) في 2D هي بالارض نموذج، somata والنمو الأقماع وثمرة المحاور-التشعبات لا يمكن أن تنتشر في كل الاتجاهات 7. (ب) نمطية 2D في المختبر شبكات المعرض ديناميات الكهربية التي تهيمن عليها تنفجر نشاط يشمل معظم الخلايا العصبية للشبكة 8.

مؤخرا، تم وضع حلول مختلفة للسماح للبناء في المختبر فصل 3D الشبكات العصبية. تتكون فكرة مشتركة في خلق سقالة حيث يمكن للخلايا العصبية تنمو بطريقة 3D. لا يمكن أن تتحقق هذه سقالة مع المواد الهلامية البوليمر والمصفوفات التي يسهل اختراقها الصلبة 13/09. من خلال استغلال الخواص الميكانيكية للبوليمرات، فمن الممكن تضمين الخلايا داخل تساهياكل البريد عن طريق تحديد كتلة موحدة من الثقافات 3D من neurospheres 11. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي ملك الميكانيكية الصارمة للneurospheres 9،12. ومع ذلك، فإن هذه المواد المسامية محدودة، وأنها لا نضمن هجرة الخلايا داخل المصفوفة. للتغلب على هذا العائق، حلا ممكنا يتكون تشريح المصفوفة إلى 'وحدة' وحدات في. لسوء الحظ، يمكن أن حجم وشكل تنوع الجسيمات تعوق التعبئة في الهياكل الطبقات العادية. في 7، كولين وزملاء العمل بتصميم بناء الخلايا العصبية 3D تتكون من الخلايا العصبية و / أو النجمية ضمن الخلية سقالة القائم على المصفوفة النشطة بيولوجيا. هذه الأنسجة العصبية المهندسة سمحت في التحقيقات المختبر لدراسة ومعالجة استجابات العصبية الحيوية داخل البيئات الصغرى 3D. يتكون هذا النموذج من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية توزع في جميع أنحاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) و / أو السقالات هيدروجيل (500-600 ميكرون سميكة). في هذا التعاونتم العثور على ndition، وبقاء الخلية المثلى (أكبر من 90٪) من خلال طلاء الخلايا في مناطق ذات كثافة النهائية حول 3750 - 5000 خلية / ملم 3. وتجدر الإشارة إلى أن هذه القيمة كثافة أقل بكثير من واحد في حالة في الجسم الحي، حيث الكثافة خلية من خلايا القشرة مخ الفأر حوالي 90000 خلية / ملم 3 14. للتغلب على هذا القيد Pautot وزملاء العمل 15 حققت 3D في المختبر نظام حيث يتم التحكم في كثافة الخلايا والاتصال بالشبكة تشبه في ظروف الجسم الحي في حين تمكن في الوقت الحقيقي التصوير من الشبكة. عمليا، يقوم هذا الأسلوب على مفهوم فصل الخلايا العصبية مثقف هي قادرة على النمو على بلي السيليكا. توفر هذه الخرز سطح نمو كبيرة بما يكفي لأجسام الخلايا العصبية على الالتزام وarborizations على النمو، وناضجة، تمديد، وتحديد الاتصالات متشابك على الخلايا العصبية الأخرى. هذا الأسلوب يستغل خصائص التجمع العفوي من الخرز فرقت أحادية لFOالطبقات جمهورية مقدونيا 3D صفائف سداسية تحتوي على مجموعات فرعية متميزة من الخلايا العصبية في طبقات مختلفة مع اتصال مقيدة بين الخلايا العصبية في حبات مختلفة. كانت كثافة الخلايا التي تحققت مع هذا الأسلوب عن 75000 خلية / مم 3.

في الآونة الأخيرة، ونحن تكيفت طريقة Pautot في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف 16: وتظهر النتائج أن النشاط الكهربية 3D يعرض ذخيرة واسعة من الأنشطة من واحد التي أعربت عنها الشبكات 2D. ثقافات ناضجة 3D يحمل ديناميكية معززة فيه كل انفجار شبكة وعشوائي تصاعد النشاط جنبا إلى جنب. وبالمثل، تانغ Schomer وزملاء العمل 17 أدرك سقالة مسامية على البروتين والحرير الذي يحافظ على الثقافة القشرية الأولية في المختبر لعدة أشهر، وسجلت النشاط الكهربية عن طريق التنغستن القطب.

في هذا العمل، والإجراءات التجريبية لبناء الشبكات العصبية 3D بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ويمكن وصفها.

Protocol

وتمت الموافقة على بروتوكول تجريبي بموجب التشريع الأوروبي رعاية الحيوان (2010/63 / EU)، من قبل وزارة الصحة الإيطالية وفقا للDL 116/1992 وفقا للمبادئ التوجيهية للجامعة جنوى (بروت. N. 13130، مايو 2011). تم بذل كل الجهود للحد من عدد الحيوانات للمشروع والتقليل من معاناتهم.

1. إعداد المواد ويدعم

  1. بناء قالب لبناء PDMS (بولي ميثيل-Siloxane) القيد عن طريق CNC (الكمبيوتر التحكم العددي) آلة الطحن. ويتحقق هذا العفن في البولي مع الاسطوانة المركزية في تترافلوروإيثيلين (PTFE). هذه المواد يسمح لاستخراج أسهل من القناع مرة واحدة وقد تصلب PDMS.
    ملاحظة: تصميم القالب تم يؤديها بمساعدة الحاسوب التصميم (CAD) ومن ثم تسليمها إلى آلة طحن CNC.
  2. إعداد المطاط الصناعي PDMS. PDMS هو بوليمر عضوي. وهو يتألف من عنصرينوكيل علاج والبوليمر. مزجها من قبل نسبة حجم 01:10، جزء واحد من وكيل علاج وتسعة أجزاء من البوليمر. وضع هذين العنصرين في طبق بيتري، ويهز إدراج المزيج في فراغ الغرفة لمدة 10 دقيقة للقضاء على فقاعات الهواء. 3 غرام من PDMS كافية لعقبة واحدة.
  3. بناء القيد PDMS. إدراج مادة PDMS في أبلى ووضعها في الفرن لمدة 30 دقيقة في 120 درجة مئوية. القيد PDMS ديه على شكل اسطوانة مثالية مع القطر الخارجي والداخلي 22.0 و 3.0 ملم على التوالي وارتفاع 650 ميكرون.
  4. قبل يوم من الطلاء، واثنين من قناع لمنطقة نشطة من المصفوفات الدقيقة الكهربائي (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) عن طريق منتاش تحت stereomicroscope وتعقيم قناع PDMS في الفرن على 120 درجة مئوية.
  5. تعقيم بلي زجاجي دقيق (القطر الاسمي من 40 ± 2 ميكرون، شهادة قطر متوسط ​​42.3 ± 1.1 ميكرون) في 70٪ من الإيثانول لمدة 2 ساعة في قارورة المخروطية وتدوير EVريها 30 دقيقة للكشف عن بلي.
  6. إزالة حل الإيثانول من القارورة وشطف بلي مرتين بالماء المعقم.
  7. شرط الجزء المركزي من منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا محددة بواسطة قناع PDMS (قطر يساوي 3.0 مم) مع 24 ميكرولتر من محلول خليط من بولي-D-ليسين و laminin في 0.05 ميكروغرام / مل.
  8. معطف بلي مع بروتينات الالتصاق، Laminin وبولي-D-ليسين في 0.05 ميكروغرام / مل وترك لهم بين عشية وضحاها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، للحصول على الشبكة العصبية مستقرة وطويلة الأمد.
  9. إزالة عوامل التصاق كلا من السطح الزجاجي لMEA ومن بلي زجاجي دقيق. نضح ما يقرب من 95٪ من الحل طلاء مع ماصة وتطبيق volume- صغيرة 24μl- من الماء المعقم على سطح MEA. نضح مرة أخرى أكثر من 95٪ من المياه، والسماح للMEA الجافة تحت غطاء محرك السيارة الصفحي لمدة 1 ساعة قبل طلاء الخلايا.
    ملاحظة: في حالة بلي بدلا من ذلك، نضح طلاءحل وجعل غسل الأولى مع الماء المعقم وثانية واحدة مع المتوسط ​​القاعدية وملحقها مثل B27، من أجل تلطيف سطح الزجاج حيث سيتم مطلي الخلايا العصبية. لا تدع بلي الجافة. تركها في تعليق في مستنبت داخل القارورة.
  10. توزيع، عن طريق ماصة -200 μl-، تعليق بلي المعالجة (حوالي 32،000) على طبق من ذهب multiwell مع إدراج غشاء (المسام قطرها 0.4 ميكرون) حيث سيتم تجميع الذاتي تشكيل طبقة موحدة.
  11. ملء كل بئر من الغشاء مع 0.5 مل من المتوسط ​​وضعه في الحاضنة (T = 37.0 درجة مئوية، CO 2 = 5٪) حتى الخلايا العصبية على استعداد لتكون مطلية (3.2).

2. تشريح الأجنة وتفكك النسيج

  1. بيت الكبار إناث الفئران (200-250 ز) في درجة حرارة ثابتة (22 ± 1 درجة مئوية) ورطوبة نسبية (50٪) في إطار جدول زمني للضوء الظلام العادي (الضوء على 07:00 حتي 07:00) فيمنشأة الحيوان. ضمان أن المواد الغذائية وهي المياه المتاحة بحرية.
  2. تخدير الفئران الإناث الحوامل بعد 18 يوما من وضع (E18) باستخدام 3٪ الأيزوفلورين. ثم، التضحية الحيوانية خلع عنق الرحم.
  3. إزالة الحصين من كل جنين فأر ووضعها في محلول ملحي متوازن الجليد الباردة هانك دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+. في يوم 18 من الحصين التنمية وأنسجة القشرة لينة جدا ولست بحاجة إلى أن تقطع الى قطع صغيرة. مزيد من التفاصيل يمكن الاطلاع على 18،19.
  4. فصل الأنسجة في 0.125٪ من حل التربسين / هانك تحتوي على 0.05٪ من الدناز عن 18-20 دقيقة عند 37 ° C.
  5. إزالة الحل طاف مع ماصة باستور ووقف الهضم الأنزيمي بإضافة المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لمدة 5 دقائق.
  6. إزالة المتوسطة مع FBS ويغسل مرة واحدة مع المتوسط ​​مع ملحقها، 1٪ L-الجلوتامين، جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل. إزالة مرة أخرى على المدى المتوسط ​​مع نقطة باستورETTE وإعادة ملء مرة أخرى مع كمية صغيرة (500 ميكرولتر) من متوسط ​​النمو مع ملحقها، 1٪ L-الجلوتامين، جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل.
  7. فصل بيليه الأنسجة ميكانيكيا مع ماصة باستور الضيقة حتى تعليق حليبي الخلايا هو واضح. ليس من الضروري أن أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية.
  8. تمييع كمية صغيرة من تعليق الخلية مع متوسط ​​النمو للحصول على الحجم النهائي من 2.0 مل. عد تركيز الخلوية التي تم الحصول عليها مع غرفة عدادة الكريات. تمييع هذا التركيز في 1: 5 من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوبة من 600-700 خلية / ميكروليتر.

3. خلية التصفيحات

  1. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة حوالي 2000 خلية / ملم 2 على منطقة نشطة للMEA، التي يحددها القيد PDMS لإنشاء شبكة العصبية 2D.
    ملاحظة: كل الحصين يحتوي على حوالي 5 × 10 5 خلايا (1 × 10 6 لجنين واحد). تشريح 6 الأجنة للحصول على المبلغ الإجمالي لل6 × 106 الخلايا في 2 مل، وتركيز قدر من 3000 خلية / ميكرولتر. تمييع هذا التركيز في 1: 5 من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوبة وصفيحة حول 600-700 خلية / ميكروليتر. إذا كانت المنطقة MEA محدد بواسطة القيد PDMS حوالي 7.065 مم 2، والعدد الكلي للخلايا مطلي 600 خلية / ميكرولتر × 24 ميكرولتر = 14،400 الخلايا، وكثافة الأخيرة من 2038 خلية / ملم 2.
  2. وضع أجهزة MEA في حاضنة مع ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية.
  3. توزيع 160 ميكرولتر من تعليق مع تركيز خلية من خلايا 600-700 / ميكرولتر (حوالي 100،000 الخلايا) على سطح أحادي الطبقة بلي المتمركزة داخل لوحات multiwell لاستكمال خطوة تمهيدية لبناء ثقافة ثلاثية الأبعاد. وضع لوحات multiwell في الحاضنة مع ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية.

البناء 4. 3D الشبكة العصبية

  1. 6-8 ساعة بعد الطلاء، ونقل تعليق (بلي مع الخلايا العصبية) من لوحات multiwell بعناية فائقة داخل منطقة محددة من قبل القيد PDMS باستخدام ماصة مجموعة لحجم حوالي 30-40 ميكرولتر. بعد كل عملية تحويل، الانتظار لمدة نصف دقيقة، للسماح للبلي في التجمع الذاتي في هيكل مدمج سداسية.
  2. مرة واحدة يتم إيداع جميع الطبقات وعفوية تجميعها، إعادة ملء مع انخفاض كبير حوالي 300 ميكرولتر من المتوسطة الجزء العلوي من منطقة محددة من قبل القيد PDMS.
  3. وضع هيكل 3D بالإضافة إلى MEA في حاضنة (T = 37.0 درجة مئوية، CO 2 = 5٪) لمدة 48 ساعة قبل أن يضيف الحجم النهائي (حوالي 1 مل) من النمو مستنبت مع ملحقها.
    ملاحظة: النظر في عدد من الخرز على لوحات multiwell مع إدراج غشاء (30000) وعدد من الخرز على طبقة واحدة على الجهاز MEA (6000). ويتكون هيكل 3D الناتجة من 5 طبقات من ميلcrobeads والخلايا. مع الأخذ بعين الاعتبار أن الشبكة العصبية 3D ليست مثالية هندسيا، يمكن أن يتألف هيكل 3D الناتجة من 5-8 طبقات.
  4. اليوم بعد الطلاء، إضافة إلى الحجم النهائي من المتوسط ​​(حوالي 900 ميكرولتر) داخل الحلبة MEA بعناية. الحفاظ على الثقافات 3D في ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 4-5 أسابيع. استبدال نصف المتوسط ​​مرة واحدة في الأسبوع.

5. متحد البؤر المجهري شراء

  1. إصلاح العينات البيولوجية إلى مرحلة المجهر في حامل. ضبط الليزر (الأرجون، 496-555 نانومتر)، وسرعة المسح الضوئي (400 هرتز) الذي لالتقاط الصور، وكسب وتعويض (-0.3٪) من PMT لكل صورة لالتقاط الصحيح مرشح الانبعاثات وعرض النطاق الترددي من أجل لتجنب التشبع وزيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء. تقارير قسم النتائج والقيم المستخدمة للحصول على الصور من الشكل 4.
  2. لاقتناء ض -stack تسلسل، والتنوبالحادي وتحديد، وقيمة موقف Z من أعلى وأسفل طبقة من العينة، ثم حدد حجم الخطوة إلى جعل عملية الاستحواذ.

النتائج

. في هذا الإجراء التجريبي، لعبت دورا ذات الصلة من قبل بلي التي تحدد سقالة الميكانيكية لنمو الشبكة العصبية 3D أرقام 1A و B عرض الترتيب من بلي (القطر الاسمي من 40 ± 2 ميكرون، شهادة يبلغ متوسط ​​قطر 42.3 ± 1.1 ميكرون) في الطائرة. خصوصية هذه الهياكل هي أن بلي عفويا التجمع ...

Discussion

في هذا العمل، وهو تجريبية جديدة في منصة المختبر تتكون من 3D هندستها الثقافات العصبية بالإضافة إلى تم تقديمه الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لشبكة الكهربية. وقد تم استخدام بلي كما سقالة للسماح ثمرة التهاب الأعصاب على طول ض -axis مصممة لتكون متكاملة مع M...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

الكتاب أشكر جورجيو كرليني للدعم الفني في تطوير بنية الحبس وDOTT. أورنيلا LoBrutto لمراجعة شاملة للمخطوطة. تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج بتمويل من البرنامج الإطاري ال 7 للاتحاد الأوروبي (ICT-FET FP7 / 2007-2013، FET يونغ مخطط المستكشفين) بموجب اتفاقية منحة 284772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
LamininSigma-AldrichL20200.05 µg/ml
Poly-D-lysineSigma-AldrichP64070.05 µg/ml
TrypsinGibco25050-0140.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAaseSigma-AldrichD50250.05% diluted  in Hanks solution
NeurobasalGibco Invitrogen21103049culture medium
B27Gibco Invitrogen175040442% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF-244210%
Glutamax-I Gibco350500380.5 mM
gentamicinSigma-AldrichG.12725mg/liter
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)Corning Sigma481939curing agent and the polymer
Micro-Electrode ArraysMulti Channel Systems (MCS)60MEA200/30-Ti-prMEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
MicrobeadDistrilab-Duke Scientific9040 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm
TranswellCostar SigmaCLS 3413multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++ Gibco Invitrogen14175-052
Hanks Buffer Solution Sigma H8264
TeflonSigma430935-5Gpolytetrafluoroethylene
RatSprague DawleyWistar Rat
Confocal Microscopy UprightLeicaTCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objectiveLeicaLeica HCX APO L U-V-I 
40.0x0.80 WATER objectiveLeicaLeica HCX APO L U-V-I 
25.0x0.95 WATER objectiveLeicaHCX IRAPO L

References

  1. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
  2. Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
  3. Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
  4. Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
  5. Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
  6. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
  7. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
  8. Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
  9. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
  10. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
  11. Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
  12. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
  13. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
  14. Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
  15. Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
  16. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
  17. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
  18. Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cell. , (1998).
  19. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
  20. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
  21. Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
  22. Frega, M., et al. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. , 957-960 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

104 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved