התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם ניסיוני

Summary

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Abstract

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Introduction

ברשתות מבחנה דו-ממדיות (2D) עצביות מצמידים את מיקרו-אלקטרודה מערכים (MEAs) עלה יפה אימץ ללמוד את יחסי הגומלין בין דינמיקה העצבית והקישוריות הבסיסית מודל ניסיוני זהב סטנדרטי. במהלך הפיתוח, נוירונים לשחזר רשתות מורכבות המציגות גם פעילות definedspatio-temporalpatternsof ^1,2 (כלומר, התפרצויות, התפרצויות רשת, פעילות spiking אקראית). MEAs להקליט את פעילות אלקטרו מאתרים רבים (בין עשרות לאלפים microelectrodes), המאפשר חקירה מפורטת של הדינמיקה הביעה ברמת הרשת. בנוסף, השימוש בתרבויות ניתק עושה possibile לעצב מהונדסות-רשתות. זה קל יותר להבין בדרך זו את היחסים הפונקציונליים בין פעילות אלקטרו נרשמה והפרמטרים של ארגון הרשת כמו תא צפיפות ^3, מידת המודולריות ^4,5, נוכחות של פופ העצבי הטרוגנית⁶ ulations, וכו 'עם זאת, כל במבחנה בתאים בתרבית ניתקו מבוססת על רשתות עצביות 2D. גישה זו מובילה לפשטנותן ביחס למערכת בvivo (3 ממדים מהותי, 3D): (i) בקונוסים מודל, somata וצמיחת 2D הם שטוחים ותולדת האקסונים-דנדריטים לא יכול להתפשט לכל הכיוונים ^7. (Ii) במבחנה תערוכת רשתות 2D סטריאוטיפית דינמיקת אלקטרו נשלטה על ידי מתפוצץ פעילות הכרוכה ברוב הנוירונים של הרשת ^8.

לאחרונה, פתרונות שונים פותחו כדי לאפשר הבנייה של במבחנה 3D ניתק רשתות עצביות. הרעיון המשותף מורכב ביצירת פיגום שבו תאי עצב יכולים לגדול בצורה 3D. כגון פיגום יכול להתממש עם ג'לי פולימר ומטריצות נקבוביות מוצקות ^9-13. על ידי ניצול התכונות מכאניות של הפולימרים, ניתן להטביע בתוך תאים thesמבני דואר על ידי הגדרת בלוק אחיד של תרבויות 3D של neurospheres ^11. התכונה העיקרית של גישה זו היא הרכוש המכני הנוקשה של neurospheres ^9,12. עם זאת, חומרים אלה נקבוביות מוגבלים, והם לא מבטיחים נדידת תאים בתוך המטריצה. כדי להתגבר על חסרון זה, פתרון אפשרי מורכב בחיתוך המטריצה ​​לתוך מודולים 'יחידה'. למרבה הצער, את מגוון הגודל וצורה של החלקיקים עלול להקשות על האריזה למבנים שכבתיים רגילים. ב ^-7, קאלן ועמיתים לעבודה שנועדו לבנות עצבי 3D מורכב מתאי עצב ו / או האסטרוציטים בתוך פיגום מבוסס מטריקס ביו. כגון רקמה עצבית מהונדסת אפשרה בחקירות מבחנה ללמוד ולתפעל תגובות נוירו-ביולוגיות בתוך מיקרו-סביבות 3D. מודל זה מורכב מתאי עצב וגליה מופצים ברחבי המטריצה ​​תאית (ECM) ו / או פיגומי הידרוג'ל (500-600 מיקרומטר עבה). בשיתוף זהndition, כדאיות אופטימלית תא (יותר מ 90%) נמצאה על ידי תאי ציפוי בצפיפות סופית של כ 3,750 - 5,000 תאים / מ"מ ^3. יש לציין שערך כגון צפיפות נמוך בהרבה מזה שבמצב in vivo, שבו צפיפות התאים בקליפת מוח העכבר היא כ 90,000 תאים / מ"מ ^{3 14.} כדי להתגבר על מגבלה זו Pautot ועמיתים לעבודה ¹⁵ הבינו במבחנה מערכת 3D שבו צפיפות תאים וקישוריות לרשת נשלטות להידמות בתנאי vivo תוך שהוא מאפשרים הדמיה של הרשת בזמן אמת. למעשה, שיטה זו מבוססת על הרעיון שניתק נוירונים בתרבית יכולים לגדול על microbeads סיליקה. חרוזים אלה מספקים משטח צמיחה גדול מספיק עבור גופי תא עצביים לדבוק ולarborizations לגדול, בוגר, להאריך, ולהגדיר קשרים סינפטיים לנוירונים אחרים. שיטה זו מנצלת את תכונות הרכבה הספונטניות של חרוזים פיזור מונו לFOrm 3D שכבתי מערכי משושים המכילים תת שונה של תאי עצב בשכבות שונות עם קישוריות מוגבלת, בין הנוירונים בחרוזים שונים. צפיפות התאים הושגו בשיטה זו הייתה על 75,000 תאים / מ"מ ^3.

לאחרונה, יש לנו השיטה מותאמת של Pautot לMEAs ^16: התוצאות שהתקבלו מראות כי פעילות אלקטרו 3D מציגה רפרטואר רחב יותר של פעילויות מזו באה לידי ביטוי על ידי רשתות 2D. תרבויות בוגרות 3D תערוכה דינמית משופר שבה שני פרץ הרשת ולהתקיים פעילות ספייק אקראית. באופן דומה, טאנג-Schomer ועמיתים לעבודה ¹⁷ הבינו פיגום נקבובי מבוסס חלבון משי אשר שומר תרבות בקליפת המוח עיקרי במבחנה במשך כמה חודשים, ורשמו את פעילות אלקטרו באמצעות אלקטרודה טונגסטן.

בעבודה זו, הפרוצדורות לבנות רשתות עצביות 3D מצמידים את MEAs יתואר.

Protocol

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הטיפול בבעלי חיים האירופי החקיקה (2010/63 / האיחוד האירופי), על ידי משרד בריאות האיטלקי בהתאם לDL 116/1992 ובהנחיות של אוניברסיטת גנואה (Prot. נ 13,130, מאי 2011). כל המאמצים שנעשו כדי להפחית את מספר בעלי החיים לפרויקט וכדי למזער את סבלם.

1. הכנת חומרים ותומכים

1. לבנות העובש לבנות PDMS האילוץ (פולי-דימתיל-siloxane) באמצעות מכונת כרסום CNC (מחשב נומרית בקרה). כגון עובש מתממש בפוליקרבונט עם הצילינדר המרכזי בpolytetrafluoroethylene (PTFE). חומר זה מאפשר מיצוי קל של המסכה פעם PDMS הקשיח.
   הערה: העיצוב של העובש שבוצעה על ידי בעזרת מחשב-עיצוב (CAD) ולאחר מכן מועברת למכונת כרסום CNC.
2. הכן את אלסטומר PDMS. PDMS הוא פולימר אורגני. הוא מורכב משני אלמנטים, סוכן ריפוי ופולימר. לערבב אותם על ידי יחס נפח של 1:10, חלק אחד של סוכן ריפוי ותשעה חלקים של פולימר. לשים את שני המרכיבים בצלחת פטרי, לנער ולהכניס את התערובת בתא הוואקום במשך 10 דקות כדי למנוע בועות אוויר. 3 גרם של PDMS מספיקים לאילוץ אחד.
3. לבנות את אילוץ PDMS. הכנס את חומר PDMS לתוך להרקב והכנסתי אותו לתנור למשך 30 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. יש אילוץ PDMS הצורה של גליל אידיאלי עם קוטר חיצוני ופנימי של 22.0 ו -3.0 מ"מ, בהתאמה וגובה של 650 מיקרומטר.
4. היום לפני הציפוי, זוג המסכה לאזור הפעיל של מערכי מיקרו-אלקטרודה (MEAs) באמצעות פינצטה תחת סטראו ולעקר את מסכת PDMS בתנור על 120 מעלות צלזיוס.
5. לעקר את microbeads הזכוכית (קוטר נומינלי של 40 ± 2 מיקרומטר; קוטר ממוצע של 42.3 מוסמך ± 1.1 מיקרומטר) באתנול 70% לשעה 2 בבקבוקון חרוטי ולסובב EVery 30 דקות כדי לחשוף את כל microbeads.
6. הסר את פתרון אתנול מהבקבוקון ולשטוף microbeads שתי פעמים עם מים מעוקרים.
7. להתנות חלק משטח MEA המופרד על ידי מסכת PDMS (קוטר שווה ל 3.0 מ"מ) עם 24 μl של פתרון המעורב של פולי-D-ליזין וLaminin ב0.05 מיקרוגרם / מיליליטר המרכזי.
8. מעיל microbeads עם חלבוני הדבקה, Laminin ופולי-D-ליזין ב0.05 מיקרוגרם / מיליליטר ולהשאיר אותם לילה בחממה על 37 מעלות צלזיוס, להשיג ברשת עצבית יציבה וארוכה טווח.
9. הסר את גורמי ההידבקות הן ממשטח הזכוכית של MEA ומmicrobeads הזכוכית. לשאוב כ -95% מפתרון הציפוי עם טפטפת ולהחיל volume- קטן 24μl- של מים סטריליים על פני השטח MEA. לשאוב שוב יותר מ -95% מהמים ולתת יבשים MEA מתחת למכסת המנוע למינרית עבור שעה 1 לפני ציפוי התאים.
   הערה: במקרה של microbeads במקום, לשאוב את הציפויפתרון ולעשות כביסה ראשונה עם מים מעוקרים ואחד שני עם המדיום הבסיסי והתוספת שלה כגון B27, כדי להתנות את משטח הזכוכית שבו נוירונים יהיו מצופים. אל תתנו microbeads יבש. להשאיר אותם בהשעיה במדיום התרבות בתוך הבקבוקון.
10. להפיץ, באמצעות פיפטה -200 μl-, ההשעיה של microbeads טופל (כ 32,000) על צלחת multiwell עם הוספת קרום (קוטר נקבובית 0.4 מיקרומטר) שבו הם יהיו עצמיים להרכיב יוצרי שכבה אחידה.
11. מלא היטב בכל הקרום עם 0.5 מיליליטר של מדיום ולשים אותו בחממה (T = 37.0 ^מעלות צלזיוס, CO ₂ = 5%) עד נוירונים מוכנים להיות מצופה (3.2).

2. Dissection של עוברים ודיסוציאציה של רקמות

1. חולדות בוגרות בית נקבה (200-250 גרם) בטמפרטורה קבועה (C 22 ± 1 °) ולחות היחסית (50%) בלוח זמני אור הכהה רגיל (אור-על 07:00-19:00) במתקן בעלי חיים. ודא שמזון ומים זמינים באופן חופשי.
2. הרדימי נקבת עכברוש הריון לאחר 18 ימים של פיתוח (E18) באמצעות 3% isoflurane. לאחר מכן, להקריב בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם.
3. הסר hippocampi מכל עובר חולדה ולהכניס אותם לתוך הפתרון של קרח הקר האנק המאוזן מלח ללא Ca ^{2 +} וMg ^{2 +.} ביום 18 בהיפוקמפוס פיתוח ורקמות קליפה רכים מאוד ולא צריכים לחתוך לחתיכות קטנות. ניתן למצוא פרטים נוספים ^18,19.
4. לנתק את הרקמה ב0.125% מהפתרון של טריפסין / האנק מכיל 0.05% מDNAse ל18-20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
5. הסר את פתרון supernatant עם טפטפת פסטר ולעצור את העיכול אנזימטי על ידי הוספה בינונית עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) במשך 5 דקות.
6. הסר את המדיום עם FBS ולשטוף פעם אחת עם המדיום עם התוספת שלו, 1% L- גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מיליליטר. הסר שוב בינוני עם PIP פסטרette ולמלא אותו שוב עם כמות קטנה (500 μl) של מדיום גידול עם התוספת שלו, 1% L- גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
7. לנתק את גלולה הרקמה מכאנית עם פיפטה פסטר צרה עד השעיה חלבית של תאים היא לכאורה. אין צורך לצנטריפוגה ההשעיה התא.
8. לדלל את הנפח הקטן של השעיה תא עם מדיום הגידול להשיג נפח סופי של 2.0 מיליליטר. לספור את הריכוז הסלולרי שהושג עם תא hemocytometer. לדלל ריכוז זה ב 1: 5 על מנת לקבל ריכוז התא הרצוי של 600-700 תאים / μl.

3. תא ציפוי

1. תאי פלייט בצפיפות של כ -2,000 תאים / מ"מ ² על האזור הפעיל של MEA, שהוגדרו על ידי אילוץ PDMS ליצור רשת עצבית 2D.
   הערה: כל ההיפוקמפוס מכיל כ 5 x 10 ⁵ תאים, (1 x 10 ⁶ לעובר יחיד). לנתח 6 עוברים כדי לקבל סכום כולל של 6 x 10⁶ תאים 2 מיליליטר, וריכוז משוער של 3,000 תאים / μl. לדלל ריכוז זה ב 1: 5 על מנת לקבל ריכוז התא הרצוי וצלחת על 600-700 תאים / μl. אם אזור MEA המופרד על ידי אילוץ PDMS הוא על 7.065 מ"מ ^2, והמספר הכולל של תאים מצופים 600 תאים / μl x 24 μl = 14,400 תאים, הצפיפות הסופית של 2,038 תאים / מ"מ ^2.
2. הנח את מכשירי MEA לתוך החממה עם CO ₂ אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס.
3. הפץ 160 μl של ההשעיה עם ריכוז תא של 600-700 תאים / μl (כ -100,000 תאים) על פני השטח של monolayer microbeads ממוקם בתוך צלחות multiwell כדי להשלים את השלב המקדים לבניית התרבות תלת-ממדית. שים את צלחות multiwell בחממה עם CO ₂ אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס.

בניית 4. רשת העצבית 3D

1. 6-8 שעות לאחר הציפוי, להעביר את ההשעיה (microbeads עם הנוירונים) מהצלחות multiwell מאוד בזהירות בתוך השטח המופרד על ידי אילוץ PDMS באמצעות פיפטה נקבעה לנפח של כ 30-40 μl. לאחר כל העברה, לחכות כחצי דק, כדי לאפשר microbeads לעצמי להרכיב במבנה קומפקטי משושה.
2. לאחר שכל השכבות מופקדות וספונטאניות התאספו, למלא עם ירידה גדולה של כ -300 μl של מדיום העליון של האזור המופרד על ידי אילוץ PDMS.
3. שים את מבנה 3D מצמידים את MEA בחממה (T = 37.0 ^מעלות צלזיוס, CO ₂ = 5%) למשך 48 שעות לפני הוספת נפח סופי (כ 1 מיליליטר) של תרבות מדיום גידול עם התוספת שלה.
   הערה: קחו למשל את המספר הכולל של חרוזים על צלחות multiwell עם הוספת הקרום (30,000) ומספר חרוזים בשכבה אחת על גבי מכשיר MEA (6000). מבנה 3D וכתוצאה מכך מורכב של 5 שכבות של מילcrobeads ותאים. אם ניקח בחשבון שהרשת העצבית 3D היא לא גיאומטרית מושלמת, מבנה 3D וכתוצאה מכך יכול להיות מורכב משכבות 5-8.
4. היום לאחר ציפוי, להוסיף בזהירות את הנפח הסופי של המדיום (כ -900 μl) בתוך טבעת MEA. לשמור על תרבויות 3D בCO ₂ אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס במשך 4-5 שבועות. להחליף מחצית בינוני פעם בשבוע.

5. מיקרוסקופיה confocal רכישה

1. תקן את הדגימות הביולוגיות לשלב של מיקרוסקופ בבעל. הגדר את הלייזר (ארגון, 496-555 ננומטר), מהירות הסריקה (400 הרץ) שבו לרכוש את התמונה, רווח וקיזוז (0.3%) של PMT עבור כל תמונה כדי ללכוד את מסנן פליטת רוחב פס הנכון וכדי כדי למנוע הרוויה ולהגדיל את יחס האות לרעש. תוצאות סעיף מדווח הערכים שימשו לרכישת התמונות של איור 4.
2. לרכישת z -stack רצף, האשוחרח 'בחר, הערך של עמדת z של החלק העליון והשכבה התחתונה של המדגם, ולאחר מכן בחר את גודל צעד כדי להפוך את הרכישה.

תוצאות

. בהליך ניסיון זה, תפקיד רלוונטי הוא שיחק על ידי microbeads המגדירים את הפיגום המכני לצמיחה של הרשת העצבית 3D איורים תצוגת 1A ו- B ההסדר של microbeads (קוטר נומינלי של 40 ± 2 מיקרומטר; קוטר ממוצע מוסמך של 42.3 ± 1.1 מיקרומטר) במטוס. הייחוד של מבנים כאלה הוא שmicrobeads באופן ס...

Discussion

בעבודה זו, ניסוי חדשני בפלטפורמת מבחנה המורכבת מ3D מהונדס תרבויות עצביות מצמידים את MEAs לאלקטרופיזיולוגיה רשת כבר הציג. השימוש בmicrobeads כפיגום לאפשר תולדת דלקת העצבים לאורך -axis z כבר מותאם להיות משולב עם MEA מישוריים. בדרך זו, תוצאות מיקרו-המערכת שהושגו במבחנת<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
Trypsin	Gibco	25050-014	0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	culture medium
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
gentamicin	Sigma-Aldrich	G.1272	5 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)	Corning Sigma	481939	curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead	Distrilab-Duke Scientific	9040	1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Buffer Solution	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	polytetrafluoroethylene
Rat	Sprague Dawley	Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0x0.80 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0x0.95 WATER objective	Leica	HCX IRAPO L