JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Аннотация

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Введение

В пробирке двумерных (2D) нейронных сетей, соединенных с микро-матриц электродов (МПС) arethe золотой стандарт, принятый экспериментальную модель для изучения взаимосвязи между нейронных динамики и основной связи. Во время разработки, нейроны воссоздать сложные сети, которые хорошо просмотров definedspatio-temporalpatternsof деятельность 1,2 (т.е. всплески, сетевые всплески, случайные пики активности). МЭС записи электрофизиологических деятельность с многих сайтах (от десятков до тысяч микроэлектродов), что позволяет детально исследовать выраженных динамики на сетевом уровне. Кроме того, использование диссоциированных культурах делает возможен спроектировать инженерии-сети. Это легче понять, таким образом, функциональные отношения между записанной электрофизиологических деятельности и параметры сетевой организации как плотность клеток 3 степени модульности 4,5, наличие гетерогенной нейронов попленностей 6, и т.д. Однако, все исследования в пробирке на диссоциированных клеток, культивируемых на основе нейронных сетей 2D. Такой подход приводит к чрезмерному упрощению по отношению к (внутренне 3-мерной, 3D) системы в естественных условиях: (I) в 2D модели, somata и роста конусов уплощенных и аксонов дендриты-вырост не могут распространяться во всех направлениях 7. (II) 2D в пробирке сети экспонат стереотипные электрофизиологические динамику с преобладанием трещит деятельность, связанную большинство нейронов сети 8.

Недавно различные решения были разработаны, чтобы позволить строительство в пробирке 3D диссоциирует нейронные сети. Общая идея состоит в создании эшафот, где нейроны могут расти в 3D моде. Такой каркас может быть реализован с полимерными гелями и твердых пористых матриц 9-13. Эксплуатируя механические свойства полимеров, можно вставлять внутрь клетки Фесе структур, определяя единую блок 3D культур нейросфер 11. Главной особенностью этого подхода является жесткая механическая собственностью нейросфер 9,12. Тем не менее, эти материалы имеют ограниченный пористость, и они не гарантируют миграцию клеток внутри матрицы. Чтобы преодолеть этот недостаток, возможным решением состоит в том нарезки матрицы в 'Unit' модулей. К сожалению, размер и форма разнообразие частиц может помешать упаковка в обычных слоистых структур. В 7 Каллен и его коллеги разработали 3D нейронов конструкцию, составленную из нейронов и / или астроцитов в биологически активного внеклеточного матрикса на основе эшафот. Такое инженерии нервной ткани позволил в пробирке исследований для изучения и манипулирования нейробиологические ответы в 3D-среде микро. Эта модель состоит из нейронов и глии, распределенных по всему внеклеточного матрикса (ЕСМ) и / или гидрогеля каркасов (толщиной 500-600 мкм). В этом сотрудничествеndition, оптимальное жизнеспособность клеток (более 90%) была обнаружена путем культивирования клеток в конечной плотностью около 3750 - 5000 клеток / мм 3. Следует отметить, что такой значение плотности намного ниже, чем в том состоянии, в естественных условиях, где плотность клеток коры мозга мыши составляет около 90000 клеток / мм 3 14. Чтобы преодолеть это ограничение Pautot и сотрудники 15 реализована система 3D в пробирке, где плотность клеток и подключения к сети контролируются походить в условиях естественных условиях при одновременном обеспечении реального времени визуализации сети. Практически, этот метод основан на том, что культивируемые нейроны диссоциированной способны расти на силикагеле, микрогранул. Эти шарики обеспечивают поверхность роста, достаточно большой для нейронных клеточных тел придерживаться и их arborizations расти, зрелые, расширяющих и определяют синаптические контакты с другими нейронами. Этот метод использует спонтанные сборке свойства монодисперсных шариков для FORM 3D слоистых гексагональных матриц, содержащих различные подмножества нейронов на разных слоях с условной связи между нейронами на различных бусин. Достигнутый плотность клеток с помощью этого метода было около 75000 клеток / мм 3.

В последнее время мы адаптировали метод Pautot к МПС 16: полученные результаты показывают, что электрофизиологические деятельность 3D представляет широкий репертуар деятельности, чем та, выраженной 2D сетей. 3D зрелые культур проявляют повышенную динамику, в которой и сеть взрыв и случайные всплеска активности сосуществуют. Аналогичным образом, Тан-Шомер и соавторы 17 реализован белка шелка на основе пористого матрикса, который поддерживает первичный кортикальный культуру в пробирке в течение нескольких месяцев, и записали электрофизиологическое активности с помощью вольфрамового электрода.

В этой работе, экспериментальные процедуры для создания 3D нейронных сетей, соединенных с МПС будет описано.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Экспериментальный протокол был одобрен Европейской ухода за животными законодательства (2010/63 / ЕС), итальянским Министерством здравоохранения в соответствии с DL 116/1992 и руководящими принципами университета Генуи (Prot. N. 13130, май 2011). Все усилия были сделаны, чтобы уменьшить количество животных для проекта и свести к минимуму их страдания.

1. Подготовка материалов и поддерживает

  1. Построить формы на постройку PDMS (Поли-диметил-Силоксан) ограничений с помощью ЧПУ (числовым программным управлением) фрезерного станка. Такое формы осуществляется из поликарбоната с центральным цилиндром политетрафторэтилена (ПТФЭ). Этот материал позволяет легче извлечение маски после того, как ПДМС затвердеет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: дизайн формы была выполнена по автоматизированного-Design (CAD), а затем доставлен в фрезерного станка с ЧПУ.
  2. Подготовка эластомера PDMS. PDMS является органический полимер. Она состоит из двух элементов, Отвердитель и полимер. Смешайте их объемном соотношении 1:10, одна часть отвердителя и девять частей полимера. Поместите два компонента в чашке Петри, встряхнуть и вставить смесь в вакуумной камере в течение 10 мин, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. 3 г PDMS достаточно для одного ограничения.
  3. Построить ограничение PDMS. Вставьте материал PDMS в формовщика и поставить в духовку на 30 мин при 120 ° С. PDMS ограничение имеет форму идеального цилиндра с внешним и внутренним диаметром 22,0 и 3,0 мм соответственно и высотой 650 мкм.
  4. За день до посева, пара маска для активной области микро-матриц электродов (МПС) с помощью пинцета под стереомикроскопом и стерилизовать маску PDMS в духовке при 120 ° С.
  5. Стерилизация стеклянные микрошарики (номинальный диаметр 40 ± 2 мкм; сертифицированный средний диаметр 42,3 ± 1,1 мкм) в 70% этаноле в течение 2 ч в конической пробирке и вращать эВERy 30 мин, чтобы выставить все микрошарики.
  6. Удалить этанольного раствора из флакона и промыть микрошариков два раза стерилизованной водой.
  7. Condition центральную часть области MEA, ограниченной маской PDMS (диаметр равен 3,0 мм) с 24 мкл смешанного раствора поли-D-лизина и ламинин на 0,05 мкг / мл.
  8. Покрывают микрошарики адгезии протеинов, ламинин и поли-D-лизина в 0,05 мкг / мл и оставить их в течение ночи в инкубаторе при 37 ° С, чтобы получить стабильный и длительный нейронной сети.
  9. Удалить факторов адгезии, как с поверхности стекла СМЭ и со стекла микросфер. Аспирируйте примерно 95% раствора для нанесения покрытия с помощью пипетки и нанести небольшое Volume- 24μl- стерильной воды на поверхности МЭС. Аспирируйте раз больше, чем 95% воды, и пусть MEA сушат при ламинарном шкафу в течение 1 часа, прежде чем покрытие клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае микросфер вместо, аспирация покрытиераствора и сделать первой стирки стерилизованной водой и второй с базальной средой и ее дополнение, таких как B27, для того, чтобы обусловить стеклянной поверхности, где нейроны будут высевали. Не позволяйте микросферы сухой. Оставьте их в виде суспензии в культуральной среде внутри флакона.
  10. Распределить, с помощью пипетки -200 μl- суспензию обработанных микрошариков (около 32000) на многоямного пластины с мембраной вставки (диаметр пор 0,4 мкм), где они будут самосборке образуя равномерный слой.
  11. Заполните каждую лунку мембраны с 0,5 мл среды и поместить его в инкубатор (Т = 37,0 ° С, СО 2 = 5%) до тех пор, нейроны не готовы быть покрыты (3.2).

2. Вскрытие эмбрионов и диссоциация ткани

  1. Дом взрослых самок крыс (200-250 г) при постоянной температуре (22 ± 1 ° С) и относительной влажности (50%) при регулярной свет-темнота расписанию (свет от 7 утра-7 вечера) вживотное объект. Убедитесь, что пища и вода в свободном доступе.
  2. Обезболить беременную самок крыс после 18 дней развития (E18) с использованием 3% изофлуран. Затем жертву животное смещением шейных позвонков.
  3. Удалить гиппокампе крыс из каждой эмбриона и поместить их в сбалансированный солевой раствор лед холодной Хэнка без Са 2+ и Mg 2+. В день 18 гиппокампа и коры развития тканей очень мягкие и не нужно разрезать на небольшие кусочки. Дальнейшие детали могут быть найдены 18,19.
  4. Отделить ткани в 0,125% раствора трипсин / Хенкса, содержащего 0,05% ДНКазы в течение 18-20 мин при температуре 37 ° С.
  5. Удалить супернатант раствор с помощью пастеровской пипетки и остановить ферментативного расщепления добавлением среды с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в течение 5 мин.
  6. Удалить жидкость с FBS и мыть один раз со средой с его дополнением, 1% L-глутамина, гентамицина 10 мкг / мл. Удалить снова среду с пип ПастераEtte и пополнить его снова с небольшим количеством (500 мкл) среды роста с его дополнением, 1% L-глутамина, гентамицина 10 мкг / мл.
  7. Отделить ткани осадок механически с узким пипетки Пастера до молочно суспензию клеток не видно. Нет необходимости, чтобы центрифуги клеточной суспензии.
  8. Развести небольшой объем клеточной суспензии с ростовой средой, чтобы получить конечный объем 2,0 мл. Подсчитайте, полученный клеточный концентрации с гемоцитометре камеры. Развести эту концентрацию в соотношении 1: 5, чтобы получить желаемую концентрацию в клетке 600-700 клеток / мкл.

3. Покрытие сотовый

  1. Пластина клеток при плотности около 2000 клеток / мм 2 на активной области МЭС, определенные ограничения PDMS, чтобы создать 2D нейронной сети.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый гиппокамп содержит около 5 х 10 5 клеток, (1 х 10 6 на одном эмбриона). Проанализируйте 6 эмбрионов, чтобы получить общее количество 6 х 106 клеток в 2 мл, а по оценкам концентрация 3000 клеток / мкл. Развести эту концентрацию в соотношении 1: 5, чтобы получить нужную концентрацию клеток и пластины 600-700 клеток / мкл. Если площадь МЭА ограничена ограничения PDMS около 7,065 мм 2, а общее количество посеянных клеток 600 клеток / мкл 24 мкл х = 14400 клеток, конечная плотность 2038 клеток / мм 2.
  2. Поместите МЭС устройств в инкубаторе с увлажненным СО 2 атмосферы (5%) при 37 ° С.
  3. Распределить 160 мкл суспензии с концентрацией клеток 600-700 клеток / мкл (около 100000 клеток) на поверхности монослоя микрошарики, расположенного внутри луночные планшеты для завершения предварительную стадию для построения трехмерной культуре. Поместите луночные планшеты в инкубаторе с увлажненным СО 2 атмосферы (5%) при 37 ° С.

4. 3D нейронной сети Строительство

  1. 6-8 ч после посева, передавать суспензии (микрошарики с нейронами) от луночные планшеты тщательно внутри области, ограниченной ограничения PDMS с помощью пипетки набор для объема примерно 30-40 мкл. После каждой передачи, подождите примерно полминуты, чтобы позволить микрогранулы, чтобы самостоятельно собрать в гексагональной компактной конструкции.
  2. После того как все слои нанесены и спонтанно собран, пополнить с большим падением около 300 мкл среды в верхней части области, ограниченной ограничения PDMS.
  3. Поместите структуру 3D, соединенный с МЭА в инкубаторе (T = 37,0 ° С, CO 2 = 5%) в течение 48 ч перед добавлением конечного объема (около 1 мл) среды роста культуры с дополнением.
    Примечание: Рассмотрим общее количество бусин на луночные планшеты с мембранной вставки (30000) и количество шариков на одном слое на MEA устройства (6000). В результате 3D структура состоит из 5 слоев миcrobeads и клетки. Принимая во внимание, что 3D нейронной сети не геометрически совершенным, в результате 3D структура может состоять из 5-8 слоев.
  4. На следующий день после посева, осторожно добавить Конечный объем среды (около 900 мкл) внутри кольца MEA. Поддержание 3D-культур в увлажненной атмосфере СО 2 (5%) при 37 ° С в течение 4-5 недель. Заменить половина среды один раз в неделю.

5. Приобретение конфокальной микроскопии

  1. Закрепите биологических образцов в стадии микроскопа в держатель. Установите лазер (аргон, 496-555 нм), скорость проверки (400 Гц), при которой на приобретение образ, усиления и смещения (-0.3%) ФЭУ для каждого изображения, чтобы захватить правильный фильтр излучения полосы пропускания и для того, чтобы избежать насыщения и увеличить отношение сигнал-шум. Секция Результаты сообщает значения, используемые для приобретения изображения рисунке 4.
  2. Для приобретения г -stack последовательности, пихтыул выбрать, значение г положении верхней и нижней слое образца, а затем выберите размер шага, чтобы сделать приобретение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

. В этой экспериментальной процедуры, соответствующую роль играет микрошариков, которые определяют механическую каркас для роста нейронной сети 3D фиг.1А и B Дисплей расположение микрошариков (номинальный диаметр 40 ± 2 мкм; сертифицирована средний диаметр 42.3 ± 1.1 мкм) в плоскост?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой работе, роман экспериментальный платформы пробирке из 3D инженерии нейронные культур в сочетании с МПС для сетевого электрофизиологии были представлены. Применение микросфер, как строительные леса, чтобы позволить нейритных нарост вдоль оси х г была специально дл...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

Авторы благодарят Giorgio Carlini за техническую поддержку в разработке структуры удержания и Dott. Орнелла LoBrutto для тщательного пересмотра рукописи. Исследование приводит к этим результатам получил финансирование от 7-й Рамочной Программы Европейского Союза (ИКТ-FET FP7 / 2007-2013, FET Молодой Исследователи схема) по договору гранта 284772 МОЗГА ЛУК (www.brainbowproject.eu).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
LamininSigma-AldrichL20200.05 µg/ml
Poly-D-lysineSigma-AldrichP64070.05 µg/ml
TrypsinGibco25050-0140.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAaseSigma-AldrichD50250.05% diluted  in Hanks solution
NeurobasalGibco Invitrogen21103049culture medium
B27Gibco Invitrogen175040442% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF-244210%
Glutamax-I Gibco350500380.5 mM
gentamicinSigma-AldrichG.12725 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)Corning Sigma481939curing agent and the polymer
Micro-Electrode ArraysMulti Channel Systems (MCS)60MEA200/30-Ti-prMEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
MicrobeadDistrilab-Duke Scientific9040 1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm
TranswellCostar SigmaCLS 3413multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++ Gibco Invitrogen14175-052
Hanks Buffer Solution Sigma H8264
TeflonSigma430935-5Gpolytetrafluoroethylene
RatSprague DawleyWistar Rat
Confocal Microscopy UprightLeicaTCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objectiveLeicaLeica HCX APO L U-V-I 
40.0x0.80 WATER objectiveLeicaLeica HCX APO L U-V-I 
25.0x0.95 WATER objectiveLeicaHCX IRAPO L

Ссылки

  1. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
  2. Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
  3. Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
  4. Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
  5. Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
  6. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
  7. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
  8. Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
  9. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
  10. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
  11. Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
  12. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
  13. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
  14. Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
  15. Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
  16. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
  17. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
  18. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
  19. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
  20. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
  21. Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
  22. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience1043D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены