Mikro Elektrot Diziler 3D Engineered Nöronal Kültürler Arayüz: Yenilikçi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deneysel Model

Özet

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Özet

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Giriş

Mikro-Elektrot Diziler (ÇÇA) bağlanmış in vitro iki boyutlu (2D) sinir ağları nöronal dinamikleri ve temel bağlantı arasındaki etkileşimi incelemek için benimsenen altın standart deneysel bir model arethe. Gelişimi sırasında, nöronlar iyi görüntüler karmaşık ağların yeniden definedspatio-temporalpatternsof aktivite ^1,2 (yani patlamaları, ağ patlamaları, rastgele spike aktivitesi). ÇÇA ağ düzeyinde ifade dinamiklerin ayrıntılı bir soruşturma izin birçok sitelerden (onlarca Mikroelektronlar binlerce) elektrofizyolojik etkinliğini kaydedebilirsiniz. Buna ek olarak, ayrışmış kültürlerin kullanılması mühendislik-ağları tasarım possibile yapar. Bu şekilde anlamak kolaydır kaydedilen elektrofizyolojik aktivite arasındaki fonksiyonel ilişkiler ve hücre yoğunluğu ^3, modülerlik ^4,5 derecesi, heterojen nöronal pop varlığı gibi ağ organizasyonu parametrelerivb ulations ⁶ Ancak, ayrışmış kültürlenmiş hücreler üzerindeki in vitro çalışmalar, 2D nöronal ağlar dayanmaktadır. Her yönde ⁷ yayılmış düzleştirilmiş olan 2 boyutlu modeli, somata ve büyüme konilerinin (i) ve akson-dentritler büyümesinin: Bu yaklaşım, in vivo (doğal olarak 3 boyutlu, 3D) sisteme göre basitleştirmeler yol açar. (ii) 2D in vitro ağlar sergi ^ağının 8 nöronların çoğu içeren aktivitesini patlama hakim elektrofizyolojik dinamikleri kalıplaşmış.

Son zamanlarda, farklı çözüm 3D nöronal ağlar ayrışmış in vitro yapımına izin vermek için geliştirilmiştir. Ortak fikir, nöronlar 3D moda yetişebilen bir iskele oluştururken oluşur. Bu tür bir yapı iskelesi polimer jeller ve katı gözenekli matrisler ^9-13 ile gerçekleştirilebilir. Polimerlerin mekanik özelliklerini istismar ederek, bu thes içinde hücrelerin gömmek mümkünneurospheres ¹¹ 3D kültürleri üniform bir blok tanımlayarak e yapıları. Bu yaklaşımın temel özelliği neurospheres ^9,12 katı mekanik özelliğidir. Ancak, bu malzemelerin gözeneklilik sınırlı ve onlar matrisi içinde hücre göçü garanti etmemektedir. Bu dezavantajı aşmak için, olası bir çözüm 'birim' modülleri matrisi dilimleme ibarettir. Ne yazık ki, parçacıkların büyüklüğü ve şekli çeşitliliği düzenli katmanlı yapılara ambalaj engel olabilir. ^7'de, Cullen ve arkadaşları, biyoaktif bir hücre dışı matris bazlı iskele içinde nöronlar ve / veya astrositlerin oluşan bir 3D nöronal yapı olarak tasarlanmıştır. Böyle bir mühendislik nöral doku 3D mikro-ortamlar içinde nörobiyolojik yanıtları incelemek ve işlemek için in vitro araştırmalarda izin verdi. Bu model ekstrasellüler matriks (ECM) ve / veya hidrojel iskeleleri (500-600 mikron kalınlığında) boyunca dağıtılan nöron ve glia oluşuyordu. Bu co^/ mm3 5000 hücreleri - ndition, optimum hücre canlılığı (% 90'dan fazla) 3.750 nihai yoğunlukta hücreler kaplanarak bulunmuştur. Böyle bir yoğunluk değeri fare beyin korteks hücre yoğunluğu yaklaşık 90,000 ^hücre / mm3 ^14, in vivo bir durumda bir, çok daha düşük olduğunu belirtmek gerekir. Bu sınırlama Pautot üstesinden gelmek ve ¹⁵ hücre yoğunluğu ve ağ bağlantı ağının gerçek zamanlı görüntüleme sağlarken in vivo koşullarında benzer şekilde kontrol edilmektedir 3B, in vitro bir sistem hayata coworkers için. Pratikte, bu yöntem kültürlü nöronlar silis mikro büyümeye edebiliyoruz ayrışmış kavramına dayanmaktadır. Bu boncuklar uyması nöronal hücre gövdeleri ve olgun büyümek uzatmak ve diğer nöronlara sinaptik kişileri tanımlamak için kendi arborizations için yeterince büyük bir büyüme yüzey sağlar. Bu yöntem, fo mono-disperse boncuk kendiliğinden düzeneği özelliklerini kullananrm 3D farklı boncuklar üzerinde nöronlar arasındaki kısıtlı bağlantısı ile farklı katmanlarda nöronların farklı alt kümelerini içeren altıgen diziler katmanlı. Bu yöntemle elde edilen hücre yoğunluğu ^/ mm3 yaklaşık 75,000 hücre idi.

Son zamanlarda, biz ÇÇA'lar ¹⁶ Pautot yöntemi adapte olması: Elde edilen sonuçlar 3D elektrofizyolojik aktivite 2D ağlar tarafından ifade olandan faaliyetlerinin geniş bir repertuara sunan olduğunu göstermektedir. 3D olgun kültürler gelişmiş bir dinamik sergiler hangi ağ patlaması ve rastgele başak aktivite bir arada hem. Benzer şekilde, Tang ve arkadaşları, ¹⁷ Schomer birkaç ay in vitro primer kortikal kültür muhafaza eden bir ipek proteini bazlı gozeneklı iskeleyi fark ve tungsten elektrot ile elektrofizyolojik aktivite göstermiştir.

Bu çalışmada, deneysel prosedürleri ÇÇA bağlanmış 3D nöron ağları kurmak için tarif edilecektir.

Protokol

Deneysel protokol DL 116/1992 uyarınca ve Genova (Prot Üniversitesi kurallar tarafından İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından Avrupa Hayvan Bakım Mevzuatı (2010/63 / EU), tarafından kabul edildi. N. 13130, Mayıs 2011). Tüm çabalar proje için hayvanların sayısını azaltmak ve onların acılarını en aza indirmek için yapılmıştır.

Malzeme ve Destekler 1. Hazırlık

1. CNC (Computer Numerical Control) freze makinesi vasıtasıyla PDMS (Poly-Dimetil-Siloxane) kısıtlama oluşturmak için kalıp Construct. Bu tür bir kalıp politetrafloroetilen merkezi silindir (PTFE), polikarbonat gerçekleştirilmektedir. PDMS sertleştikten sonra bu malzeme maske daha kolay bir çıkarma verir.
   NOT: kalıp tasarımı Bilgisayar Destekli-Tasarım (CAD) tarafından gerçekleştirilen ve daha sonra CNC Freze makinesine teslim edilmiştir.
2. PDMS elastomer hazırlayın. PDMS bir organik polimerdir. Bu iki eleman oluşmaktadır, Bir kürleme maddesi ve bir polimer içerir. 1:10 hacim oranında karıştırın, sertleştirici madde bir kısmı ve polimerin dokuz kısım. Bir Petri kabındaki iki bileşen koymak sallamak ve hava kabarcıklarını yok etmek için 10 dakika süreyle vakum odasında karışımı yerleştirin. PDMS 3 g bir kısıtlama için yeterlidir.
3. PDMS kısıtlamayı Construct. Kalıpçı içine PDMS malzemeyi yerleştirin ve 120 ° C'de 30 dakika süreyle fırına koyun. PDMS kısıtlama, sırasıyla 22,0 ve 3,0 mm'lik bir dış ve iç çapa ve 650 mm yüksekliğe sahip ideal bir silindir şekline sahiptir.
4. Kaplama bir gün önce, çiftin bir stereo mikroskop altında bir cımbız yardımıyla Mikro Elektrot Diziler (ÇÇA) aktif alana maske ve 120 ° C'de fırında PDMS maskesi sterilize edin.
5. Konik bir cam şişede 2 saat boyunca% 70 etanol içinde ve EV döndürme (42,3 ± 1,1 um onaylı ortalama çapı 40 ± 2 um nominal çap), cam mikro-boncuklar sterilizeery 30 dakika tüm mikroboncukları ortaya çıkarmak.
6. Tüpten etanol çözüm çıkarın ve mikroboncukları steril su ile iki kez yıkayın.
7. 0,05 ug / ml poli-D-Lisin, Laminin karışık çözeltisi 24 ul (çap 3.0 mm eşittir) PDMS maske tarafından sınırlanan MEA alanının orta kısmını hale getirin.
8. Coat 0,05 ug / ml'de yapışma proteinleri, önceden laminin ve poli-D-lisin ile mikro-mi ve stabil ve uzun süreli bir nöronal ağ elde etmek için, 37 ° C 'de gece boyunca inkübatör içinde bırakın.
9. MEA cam yüzeyinden ve cam mikro hem yapışma faktörleri çıkarın. Aspire bir pipet ile kaplama çözeltisinin yaklaşık olarak% 95 ve MEA yüzeyi üzerinde, steril su, küçük bir hacimlerinde 24μl- uygulanır. Aspire yine 95'den fazla su ve% hücreleri kaplama önce 1 saat boyunca laminer kaputun altında MEA kurumaya bırakın.
   Not: yerine mikro-boncuk halinde, kaplama aspireçözüm ve nöronlar kaplama olacak cam yüzeyi kondisyon için, sterilize su ve bazal orta ve B27 olarak ek ikinci bir biriyle ilk yıkama yapın. Mikro-kuru izin vermeyin. Şişe içine kültür ortamı içinde süspansiyon halinde bırak.
10. Bunlar tek biçimli bir tabakasını oluşturan kendi kendini monte edecek ve membran deliğinden (gözenek çapı 0,4 um) olan, çok oyuklu bir plaka üzerine bir pipet -200 μl-, tedavi edilen mikro-boncuk süspansiyonu (yaklaşık 32000) aracılığıyla, dağıtın.
11. Orta 0.5 ml membran Her çukurun doldurun ve inkübatör koydum (T = 37.0 ^{o C,} CO ₂ =% 5) nöronlar (3.2) kaplama için hazır olana kadar.

2. Embriyolar diseksiyonu ve Doku Ayrılma

1. Normal bir ışık-karanlık program dahilinde sabit bir sıcaklıkta (22 ± 1 ° C) ve nem (% 50) Ev yetişkin dişi sıçanlar (200-250 g) (ışık-07:00-7 pm) 'dehayvan tesisi. Bu yiyecek sağlanması ve su serbestçe kullanılabilir.
2. % 3 izofluran kullanarak geliştirme 18 gün (E18) sonra hamile kadın sıçan anestezisi. Ardından, servikal dislokasyon ile hayvan kurban.
3. Her sıçan embriyo hippocampi çıkarın ve Ca ²⁺ ve Mg olmadan buz Hank dengeli tuz çözeltisi ²⁺ içine koyun. Günde gelişim hipokampus ve korteks dokuları 18 Çok yumuşak ve küçük parçalar halinde kesmek için gerek yoktur. Daha fazla detay ^18,19 bulunabilir.
4. 37 ° C'de 18-20 dakika boyunca DNAz% 0.05 ihtiva eden tripsin / Hank çözeltisi 0.125% olarak doku ayırmak.
5. Pasteur pipeti ile süpernatan çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile orta eklenerek enzimatik sindirim durdurun.
6. FBS ile Ortamı çıkarın ve eki,% 1 L-glutamin, gentamisin 10 ug / ml ortam maddesi ile bir kez yıkanır. Pasteur pip ile tekrar orta kaldırmakette eki,% 1 L-glutamin, gentamisin 10 ug / ml ile bir yetiştirme ortamı küçük bir miktarı (500 ul) ile yeniden dolum ve.
7. Hücre süt rengi süspansiyon görünceye kadar dar bir Pasteur pipeti ile mekanik olarak doku topağı ayrıştırmaları. Bu hücre süspansiyonu santrifüj gerekli değildir.
8. 2,0 ml'lik bir son hacim elde etmek için büyüme ortamı hücre süspansiyonuna küçük hacimli seyreltilir. Bir hemositometre odası ile elde edilen hücresel konsantrasyon güvenin. / Ml 600-700 hücreleri istenen hücre konsantrasyonunu elde etmek üzere 5: 1 ile, bu konsantrasyon seyreltilir.

3. Hücre Kaplama

1. PDMS kısıtlaması ile tanımlanır MEA aktif alan üzerine yaklaşık 2000 hücre / ^mm2 yoğunluğunda plakası hücreleri, 2B nöronal ağ oluşturmak için.
   NOT: Her hipokampus yaklaşık 5 x 10 ⁵ hücreler içeren, (tek bir embriyo için 1 x 10 ^6). 6 x 10 toplam miktar almak için 6 embriyolar teşrih⁶ 2 ml hücre ve / ml 3000 hücre tahmini konsantrasyonu. İstenilen hücre konsantrasyonunu elde etmek ve yaklaşık 600-700 hücre / ul plaka için 5: 1 bu konsantrasyon sulandırmak. PDMS kısıtlaması tarafından sınırlanan MEA alanı yaklaşık 7,065 mm ² ve kaplama toplam hücre sayısı ise 600 hücre / ml x 24 ul = 14.400 hücre ^/ mm 2 '2038 hücrelerin nihai yoğunluğu.
2. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir _CO2 atmosferi (% 5) ile inkübatör içine MEA cihazları yerleştirin.
3. Üç boyutlu kültür yapımı için ön hazırlık aşamasını tamamlamak için yuvalı plakalarda içine yerleştirilen mikro-mono-katman yüzeyi üzerine / ml 600-700 hücreleri (yaklaşık 100,000 hücre) hücre konsantrasyonuna sahip süspansiyon 160 ul dağıtın. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir _CO2 atmosferi (% 5) ile, çok kuyucuklu bir inkübatör plakaları koyun.

4. 3D Nöronal Şebeke İnşaatı

1. 6-8 saat sonra kaplama, yaklaşık 30-40 ul'lik bir hacim için ayarlanmış bir pipet kullanılarak PDMS kısıtlaması tarafından sınırlanan bölgenin içine tamamen çok dikkatli bir şekilde, çok oyuklu plakalar ile süspansiyonu (nöronlar ile mikro-) aktarın. Her aktarımdan sonra, bir altıgen kompakt yapıda kendine monte mikroboncukları izin, yaklaşık yarım dakika bekleyin.
2. Tüm katmanlar yatırılır ve kendiliğinden monte edildikten sonra, ortam yaklaşık 300 ul PDMS kısıtlaması tarafından sınırlanan alanın üst büyük bir düşüş ile doldurun.
3. Inkübatör (T = 37,0 ^o C, CO ₂ =% 5) MEA bağlanmış 3 boyutlu yapının koyun 48 saat için takviyesi ile büyüme ortamı kültürünün bir son hacim (yaklaşık 1 mi) ilave edilmeden önce.
   NOT: Membran parçası (30.000) ve MEA cihazı (6000) üzerine tek bir tabaka üzerinde tanelerin sayısı ile yuvalı plakalarda boncuk sayısı göz önünde bulundurun. Elde edilen 3D yapı mi 5 tabakadan oluşurcrobeads ve hücreler. 3D nöronal ağ geometrik mükemmel olmadığı dikkate alındığında, ortaya çıkan 3D yapı 5-8 tabakadan oluşur olabilir.
4. Günlük kuluçkadan sonra dikkatli bir şekilde MEA halka içinde ortam (yaklaşık 900 ul) son hacim ekleyin. 4-5 hafta boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş bir _CO2 atmosferi (5%) 3D kültürleri koruyun. Haftada bir kez orta yarısı değiştirin.

5. Konfokal Mikroskopi Toplama

1. Bir tutucu içinde mikroskop sahneye biyolojik örnekler sabitleyin. Doğru bant emisyon filtresi ve sırayla yakalamak için her resim için PMT imajı, kazanç ve ofset (-0.3%) elde etmek için hangi lazer (Argon, 496-555 nm), tarama hızı (400 Hz) olarak ayarlayın doymasını önlemek için ve sinyal gürültü oranını geliştirmek için. Sonuçlar Bölüm Şekil 4 görüntüler elde etmek için kullanılan değerler bildirir.
2. Z -stack dizisi, köknar edinimi içinst, üst ve numunenin alt tabakanın z pozisyonuna değerini seçin ve sonra satın alma yapmak için adım boyutunu seçin.

Sonuçlar

. Bu deneysel prosedürde, ilgili bir rol 3D nöronal ağın büyüme için mekanik iskele tanımlayan mikro-oynanır Şekil 1A ve B Ekran mikro-boncuk düzenlemesi (40 ± 2 um nominal çap diyagramlarıdır; sertifikalı ortalama çapı düzlemde 42.3 ± 1.1 mikron). Bu tür yapıların özelliği mikroboncukları kendiliğinden kompakt altıgen geometri (Şekil 1B ve C) tanımlayan kendine monte olmasıdır. Böylece oluşturulan iskele nörit ve hüc...

Tartışmalar

Bu çalışmada, 3D oluşan in vitro platformda yeni bir deneysel ağ elektrofizyoloji için ÇÇA sunulmuştur bağlanmış nöronal kültürleri mühendislik. Z -Axis boyunca nöritik büyümesine izin iskele olarak mikro kullanımı düzlemsel MEA ile entegre edilmek üzere özel olmuştur. Bu şekilde, geçerli ve güvenilir bir in vitro 3D model elde mikro sistem sonuçları ortaya çıkan elektrofizyolojik dinamiklerini ¹⁶ incelemek için.

MEA kay?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
Trypsin	Gibco	25050-014	0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	culture medium
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
gentamicin	Sigma-Aldrich	G.1272	5mg/liter
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)	Corning Sigma	481939	curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead	Distrilab-Duke Scientific	9040	1gr Glass Part.Size Stds 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Buffer Solution	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	polytetrafluoroethylene
Rat	Sprague Dawley	Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0x0.80 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0x0.95 WATER objective	Leica	HCX IRAPO L